樹(shù)干畢赤酵母發(fā)酵木糖生產(chǎn)燃料乙醇

第36卷第1期釀酒voL.36.N.12009年1月LIQUOR MAKING文章編號:1002-8110(200901-0023-04樹(shù)干畢赤酵母發(fā)酵木糖生產(chǎn)燃料乙醇張亞云,丁長(cháng)河,李里特,王艷敏,王羅琳(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院鄭州,450052)摘要:人們從自然界中篩選得到的能利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的酵母菌中,樹(shù)干畢赤酵母具有很大的優(yōu)勢。它不僅可以發(fā)酵木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖,而且可以發(fā)酵纖維二糖和木二糖;同時(shí)培養基中沒(méi)有生物素和硫胺素也可正常發(fā)酵,并且它發(fā)酵木糖的乙醇轉化率較高幾乎接近理論值0.51g/g。主要講述了環(huán)境因素如培養基成分、pH、溫度、乙醇濃度和底物濃度、通氧量大小等對樹(shù)千畢赤酵母發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的影響。關(guān)鍵詞:樹(shù)干畢赤酵母;木糖;燃料乙醇;發(fā)酵中圖分類(lèi)號:TS2622;TS2614;TS26111文獻標識碼:BFermentation of D-xylose for Ethanol Production by Pichia StipitisZHANG Ya-yun DING Chang-he, LI Li-te, WANG Yan-min, WANG Luo-lin(Grain and Food College, Henan University of Technology, Zhengzhou 450052, ChinAbstrct: Among the xylose-fermenting yeasts for ethanol production, Pichia stipitis was considered as the best microorganism forindustrial application. it can utilize a wide range of sugars, including xylose, glucose, mannose, galactose, and even some disac-charides, such as cellobiose and xylobiose. Furthermore, there was no absolute requirement for biotin and thiamine in the fer-mentation with a high ethanol yield( near to the theoretical yield 0.51g/g). The objective of the present work are to study the ef-fect of medium composition, pH, temperture, the concentration of ethanol and substrate, and aeration rate on the xylose fermenta-on by Pichia stipitis.Key words Pichia stipitis i Xylose Ethanol Fermentation收稿日期:2008-09-18隨著(zhù)天然氣、石油等能源的急劇消耗,汽車(chē)燃料需求的不·基金項目:河南省杰出人才創(chuàng )新基金貢助項目。項目編號:062100斷增加環(huán)境污染等問(wèn)題的日益惡化,尋找開(kāi)發(fā)新能源減少作者簡(jiǎn)介:;張亞云(1982-),女,山西長(cháng)治人,在讀碩士研究生,研究方向為糧食、油脂與植物蛋白綜合利用。環(huán)境污染的有效途徑,顯得越來(lái)越重要。近年來(lái),乙醇作為一或采用調控手段來(lái)提高糖化酶的催化水解淀粉能力將帶來(lái)突6] Nathalie Juge, Marie- Fran coise Le Gal-Co" fetI. Caroline SM.破性的進(jìn)展Furnissl, etc. The starch binding domain of glucoamylase from[參考文獻]Aspergillus niger: overview of its structure, function, and role in[Coutinho, P. M and Reilly. 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Structure of glucoamylaseNucleic Acids Res, 2005.33: 247 251from Saccharomycopsis fibuligera at 1.7 A resolution [].ActaCrystallogr D Biol Crystallogr. 1998-54(5): 854-866第一期2009種能效高、清潔、安全、可再生代替資源受到了全世界人們的重視我國每年有大量的農業(yè)廢棄物,如玉米桿、稻草、麥秸、甘蔗渣等纖維質(zhì)原料。秸桿的主要成分是木質(zhì)纖維材料( lignocellulosic materials),主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成半纖維素占木質(zhì)纖維材料成分的20%-35%,天然半纖維素水解產(chǎn)物的85%~90%是木糖但是目前它們大多數沒(méi)有被合理的利用,開(kāi)展利用農林廢棄物生產(chǎn)燃料乙醇的研究不僅可以解決農林廢棄物的利用問(wèn)題,而且可以緩解糧食和能源緊張。因此利用植物纖維材料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究,具有十分重要的現實(shí)和長(cháng)遠意義。生物秸稈廢棄物可以通過(guò)預處理和水解得到以單糖為主要成分的水解液,進(jìn)而發(fā)酵轉化為乙醇。目前水解產(chǎn)物中占絕大部分的葡萄糖可以被釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)轉化為乙醇,且發(fā)酵工藝技術(shù)較成熟。但是釀酒酵母在好氧的條件下利用木糖只能進(jìn)行呼吸代謝途徑,不能在厭氧條件下圖1畢赤氏酵母 Pichia stipitis木糖和葡萄糖代謝途徑將木糖轉化為乙醇。以植物纖維素原料中的木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙代謝葡萄糖復雜得多醇,能使纖維素原料的乙醇發(fā)酵產(chǎn)量在原有的基礎上增加3樹(shù)干畢赤酵母發(fā)酵木糖的國內外研究成果25%。因此,木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是決定植物纖維資源生產(chǎn)乙配20世紀70年代國外掀起了一股研究發(fā)酵木糖酵母的熱經(jīng)濟可行的關(guān)鍵因素潮,研究較多的為樹(shù)干畢赤酵母和休哈塔假絲酵母。他們主要1發(fā)酵木糖的酵母菌種類(lèi)研究目的為通過(guò)改變不同影響條件(如pH、溫度、通氧量、培目前有6種酵母菌能通過(guò)發(fā)酵木糖產(chǎn)生大量的乙醇:樹(shù)養基成分碳源配比等)來(lái)提高樹(shù)干畢赤酵母發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙干畢赤酵母( Pichia stipitis)、嗜鞣管囊酵母( Pachysolen醇的乙醇轉化率和生產(chǎn)能力。近年來(lái)我國也有很多研究者著(zhù)annophilus)、體哈塔假絲酵母( Candida shehatae)、季也蒙畢手這項研究,他們主要研究目的為通過(guò)基因手段來(lái)得到發(fā)酵赤酵母( Pichia guilliermondi)、酒香酵母( Bretanomyoes)和產(chǎn)木糖理想菌株。朊假絲酵母( Candida utilis)。目前人們研究最多,且具有工1986年, Du Preez研究了pH、溫度、底物濃度對樹(shù)干畢業(yè)應用前景的木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的酵母菌有兩種,即樹(shù)干畢赤酵母發(fā)酵木糖50gL的影響結果顯示最佳pH4~55,溫度赤酵母和休哈塔假絲酵母寫(xiě)為30℃,在此條件下酵母的單位體積乙醇生產(chǎn)速率為09gLh前人大量的研究表明,人們從自然界中篩選得到的能利菌體最快生長(cháng)速度0.15gh,乙醇得率為043g/g,單位體積的用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的酵母菌中,樹(shù)干畢赤酵母具有很大的乙醇生產(chǎn)速率0.86g1h優(yōu)勢。首先,它不僅可以發(fā)酵木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖,而990年,Skog等人研究了通氧量對樹(shù)干畢赤酵母且可以發(fā)酵纖維二糖和木二糖;其次,在發(fā)酵的最終產(chǎn)物中副CB6054發(fā)酵木糖的影響。培養基成分為50gL木糖67g產(chǎn)物木糖醇較少;再者,培養基中沒(méi)有維生素B和維生素HYNB,0.81/L K HPO,290g/LKH2PO4;培養條件為pH55,溫也可正常發(fā)酵,并且它發(fā)酵木糖的乙醇轉化率較高幾乎接近度30℃,空氣通量0-09/min。從結果中得知:通氧量為理論值0.518g乙醇/消耗的糖嚴5nI/L·h時(shí),乙醇得率最大為042g/g,乙醇的生產(chǎn)能力為2樹(shù)干畢赤酵母發(fā)酵木糖的代謝途徑020ggh同時(shí)當乙醇的生產(chǎn)能力最大時(shí)保持通氧量不變,丙對自然界中篩選得到的樹(shù)干畢赤酵母利用木糖的代謝途酮酸脫羧酶的活性增加蘋(píng)果酸脫氫酶活性降低。徑研究分析發(fā)現(見(jiàn)圖1,木糖進(jìn)入菌體細胞后首先在木糖2001年,劉健、陳洪章等人選育出一株優(yōu)良的木糖發(fā)酵原酶(XYL)和木糖醇脫氫酶(XYL2)的作用下轉化為木酮菌株樹(shù)干畢赤酵母菌7124,當木糖發(fā)酵條件為24h,28℃糖。木酮糖經(jīng)過(guò)木酮糖激酶(XYL3磷酸化生成5-磷酸木酮。80min0g/L木糖時(shí),乙醇產(chǎn)量為54gL,乙醇得率為5-磷酸木酮糖通過(guò)轉酮酶(TKT)及轉醛生成酵解途徑的中間027og產(chǎn)物6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛,最后產(chǎn)物16-磷酸果糖2003年 Walkom等人將木糖還原酶、木糖脫氫酶和木和3-磷酸甘油醛進(jìn)入糖酵解途徑產(chǎn)生丙酮酸。最后,在含氧酮糖中國煤化工339經(jīng)過(guò)化學(xué)誘變得較低的條件下丙酮酸經(jīng)丙酮酸脫羧酶(PDC)的催化脫羧變到了成乙醛繼而在乙醇脫氫酶(ADH的催化下形成乙醇。另外,當達CNMHGBM30的乙醇產(chǎn)率陽(yáng)原酶、木糖還原酶和酮氧氣充足時(shí)丙酮酸還可以通過(guò)乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸途徑,糖激酶的活性都要高于TMB33。最終生產(chǎn)CO2。由圖1看出樹(shù)干畢赤酵母代謝木糖的途徑比2006年, Agbogho等人研究了不同濃度的葡萄糖和木糖第一期張亞云,等:樹(shù)干畢赤酵母發(fā)酵木糖生產(chǎn)燃料乙醇2009混合物(60g/)對樹(shù)干畢赤酵母CB6054發(fā)酵生產(chǎn)乙醇過(guò)程是在各種酶的催化下進(jìn)行的唯獨是保證酶活的重要條件。從中細胞生長(cháng)速度、底物濃度、乙醇濃度和乙醇得率的影響。從酶反應的動(dòng)力學(xué)來(lái)看,溫度越高,反應速度和生長(cháng)代謝也越結果可以看出在高濃度的葡萄糖中培養時(shí),細胞的生長(cháng)速率快但是酵母細胞內的酶很容易因熱而失去活性,通常高溫培較快但乙醇的的得率較低;隨著(zhù)木糖濃度的提高,乙醇的轉養而的酵母發(fā)酵能力差且容易衰老。所以一般溫度控制在化率增加,主要是由于菌體利用底物參與了乙醇代謝途徑而30-32℃,當溫度高于30℃時(shí),乙醇的產(chǎn)量和發(fā)酵速率會(huì )大不是菌體自生生長(cháng)。這說(shuō)明樹(shù)干畢赤酵母具有發(fā)酵高濃度木大降低同時(shí)伴隨有副產(chǎn)物木糖醇的積累。 Dellweg等人(1984)糖預處理液生產(chǎn)高產(chǎn)量乙醇的潛在力指出,30℃時(shí),發(fā)酵參數:發(fā)酵時(shí)間、菌體生長(cháng)速率、乙醇轉化2007年,宋昕磊張鵬對從自然界中篩選出一株能利用率均達到最大值但是36℃乙醇轉化率降至0.29gg。同時(shí)溫木糖產(chǎn)酒精的菌株1125-3進(jìn)行發(fā)酵性能的研究,研究了不同度低于36℃發(fā)酵產(chǎn)物中未檢測到木糖醇,當高于36℃時(shí),木條件下自篩菌生長(cháng)和發(fā)酵的規律。自篩菌株定向馴化后對木糖醇含量為295g糖的利用率可達929%酒精得率達1288%菌株1125-3的4.2乙醇和木糖濃度最適生長(cháng)溫度為30℃、pH范圍為46-50,最適發(fā)酵溫度為乙醇對不同種類(lèi)的酵母的抑制作用有很大差別, Slininger"37℃H為60左右用尿素作為單一氮源自篩菌1125-3的等人(1985研究發(fā)現同樣條件下樹(shù)干畢赤酵母CBS5776乙生長(cháng)和發(fā)酵情況良好。自篩菌的混合糖發(fā)酵效果優(yōu)于單純木醇抑制濃度為39/而CBS5773為57g;溫度對乙醇濃度的糖發(fā)酵,在2.5%葡萄糖與2.5%木糖做混合碳源發(fā)酵時(shí),其酒抑制作用有顯著(zhù)影響, Du preeκ等人研究發(fā)現,在1-22℃精得率達到了純葡萄糖發(fā)酵水平時(shí)乙醇抑制濃度為44~48g/L;30℃抑制濃度降低了15g/L。同由上研究研究可以看出,樹(shù)干畢赤酵母發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙時(shí),樹(shù)干畢赤酵母CBS5773,25℃乙醇濃度為64g時(shí)細胞仍醇的能力離工業(yè)化生產(chǎn)還有一定的距離。我們仍有必要對影可生長(cháng),30℃明顯低于此值;乙醇對細胞生長(cháng)和酵母發(fā)酵的抑響樹(shù)干畢赤酵母發(fā)酵的環(huán)境因素進(jìn)行深入的研究,更好的優(yōu)制作用也有區別,樹(shù)于畢赤酵母CBS7126在乙醇濃度32-化發(fā)酵條件,提高乙醇得率35g/時(shí)細胞停止生長(cháng),而乙醇濃度44-47g幾L時(shí),乙醇轉化4影響樹(shù)干畢赤酵母發(fā)酵的環(huán)境因素才受到抑制。前人實(shí)驗數據表明,乙醇濃度對樹(shù)干畢赤酵母的41培養基成分、pH和溫度抑制作用與酵母種類(lèi)、培養條件有關(guān);釀酒酵母發(fā)酵自身轉化培養基成分和培養條件對木糖發(fā)酵有很大的影響。樹(shù)的乙醇抑制作用較外界添加乙醇的抑制作用強,而樹(shù)干畢赤干畢赤酵母當不添加維生素可以照常發(fā)酵木糖,但如果適酵母發(fā)酵自身轉化的乙醇與外界添加乙醇的抑制作用相當量添加生物素和硫胺素能成倍的提高乙醇產(chǎn)量和乙醇生許多研究表明,木糖濃度對酵母細胞生長(cháng)和乙醇轉化的產(chǎn)能力 151, Gumbel等人1984)研究了培養基成分對樹(shù)十畢赤抑制濃度不同: Laplace等人(991)發(fā)現木糖含量大于40gL酵母CBS5773發(fā)酵的影響,結果顯示生物素和硫胺素并沒(méi)有時(shí),樹(shù)十畢赤酵母CBS5773細胞生長(cháng)受到抑制,而木糖含量提高乙醇產(chǎn)量和乙醇得率?，F在很多研究結果顯示營(yíng)養豐為110gL時(shí),乙醇轉化率仍保持在04g,且沒(méi)有副產(chǎn)物木富的培養基所得的乙醇含量較高于一般培養基,同時(shí)酵母膏糖醇形成; Roberto等人(1991)指出木糖含量為76-99g能提高樹(shù)干畢赤酵母的生長(cháng)速率啁。時(shí),樹(shù)干畢赤酵母CBS5773單位體積的生產(chǎn)速率受到抑制,pH主要影響酵母細胞膜所帶電荷的狀態(tài),從而改變細胞而乙醇轉化率在木糖濃度高達145L時(shí)未見(jiàn)受到影響;膜的滲透壓影響酵母對營(yíng)養物質(zhì)的吸收和代謝物的排泄最 Slininger等人(1991)研究發(fā)現在高濃度的木糖發(fā)酵液中,樹(shù)干終影響酵母生長(cháng)和發(fā)酵的正常運行。培養基和發(fā)酵液的pH畢赤酵母的乙醇轉化率高于休哈塔假絲酵母,甚至在200gL改變會(huì )引起細胞內部各種酶活性的改變。在環(huán)境溫度不太高木糖發(fā)酵液中,乙醇轉化率為036-0.42gg,另外單位體積乙的情況下,樹(shù)干畢赤酵母可以在偏酸性的環(huán)境中生長(cháng)和發(fā)酵。醇轉化能力在木糖為100~150gL時(shí)達到最大值。但當用酵母來(lái)發(fā)酵植物纖維水解液時(shí),pH還得適當提高,由4,3通氧量大小于在酸性條件下,水解液當中的醋酸對酵母的生長(cháng)和發(fā)酵抑通氧量大小是影響酵母發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇最重要的制作用加強。前人的研究表明樹(shù)干畢赤酵母CBS7126的最環(huán)境因素,它不僅影響乙醇的轉化率和生產(chǎn)能力,而且影響副佳發(fā)酵速率pH4~55,pH2.5-6.5之間對乙醇的最終轉化率產(chǎn)物木糖醇的積累程度。在高含氧量條件下,樹(shù)干畢赤酵母通沒(méi)有太大影響。但 Du Preez(1986)研究表明樹(shù)干畢赤酵母過(guò)三羧酸途徑進(jìn)行有氧呼吸代謝木糖和葡萄糖,產(chǎn)生CO2和CSR-Y633在pH為4-55時(shí)乙醇產(chǎn)量由045eg降至生物能量ATP生長(cháng)菌體,但不發(fā)酵木糖;在厭氧條件下會(huì )導042geg,pH5時(shí)乙醇產(chǎn)量降至0.37g,同時(shí)在pH為4~55致許中國煤化工氧量時(shí)糖代謝途徑才時(shí)乙醇最佳發(fā)酵速率和產(chǎn)量均達到最大值岡。 Dellweg等人由CNMH(1984指出,在厭氧條件下pH為4時(shí) Pstepit發(fā)酵產(chǎn)物中未以途徑可以看出,丙酮見(jiàn)木糖醇積累,pH7時(shí)木糖醇含量為0.19g。酸脫羧酶和乙醇脫氫酶是乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵酶。在不同的通溫度是影響木糖發(fā)酵的一個(gè)重要參數,最佳的溫度與菌量條件下,樹(shù)干畢赤酵母誘導產(chǎn)生的丙酮酸脫羧酶和乙醇脫株的種類(lèi)底物以及其濃度有關(guān)。樹(shù)干畢赤酵母的生長(cháng)和發(fā)酵氫酶含量差別很大。 Fredlund等人(2004)研究指出在好氧條2009件下丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶的酶活較低,在微氧條件下,阝8 TwJeffrise, IV Grigore, J.Grimwood,etal. Genome sequence of其酶活提高了3倍。同時(shí),O2還作為最終的電子接受體來(lái)緩 the ligncellulose bioconvert解發(fā)酵過(guò)程前兩步木糖代謝的氧化還原不平衡,但隨著(zhù)含氧 g and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis[]. Nature Biotech量的降低,電子傳遞系統將無(wú)法氧化還原呼吸及發(fā)酵過(guò)程中nolog,200725:319-326.產(chǎn)生的 NAPDH,細胞內的 NAPDH2增加會(huì )降低NAD-木糖 9pc. Du Preez, B Machiel and BA.Prior. Xylose fermentation by Can醇脫氫酶的活性導致木糖醇的積累。因此合適的含氧量對 dida shehatae and Pichia stipitis: effects of pH temperature and酵母發(fā)酵木糖至關(guān)重要substrate concentration[. Enzyme Microb. Technol, 1986, woL 8, June[10jK.koog, B. Hahn-H? gerda. ERect of oxygenation on xylose fer5展望人們近幾十年來(lái)通過(guò)基因工程手段已獲得一些重組菌entation by Pichia stipitis [J] AppL. Environ. Microbiol., 1990株它們在厭氧條件下發(fā)酵葡萄糖和木糖的能力得到了提高,(瀏健陳洪章,李佐虎木糖發(fā)酵生產(chǎn)工藝的研究工業(yè)微生物,為植物纖維質(zhì)原料生物轉化生產(chǎn)乙醇奠定了一定的基礎,但這些工程微生物本身而言在發(fā)酵過(guò)程中還存在很多不穩定因2 Wahlbom, WH. vanzyl, L Jonsson, et al.. Generation of th素如乙醇的抑制性乙酸、醛類(lèi)、酮類(lèi)等副產(chǎn)物的發(fā)酵抑制作mproved recombinant xylose utilizing Saccharomyce用。同時(shí)轉基因菌株易于污染雜菌環(huán)境耐受力較差活力減aeTMB 400 by random mutagensis and physiological comparison弱等缺陷限制了這些菌株工業(yè)化應用。ith pichia stipitis CBS 6054 []Ferm Yeast Res, 2003, 3目前,木糖乙醇發(fā)酵技術(shù)的成功僅限于實(shí)驗室規模應用,319-326該技術(shù)離實(shí)際生產(chǎn)還有一定的距離。高成本是利用可再生的[3 Fk.Gbagbo, GC. Kell, MT. Smith, et al. Fermentation of g植物纖維質(zhì)資源制取乙醇的主要問(wèn)題之一。未來(lái)該領(lǐng)域應在 xylose mixtures using Pichia stipitis U. Process Biochemistry以下幾個(gè)方面做出更大的努力:從自然界中篩選出發(fā)酵木糖200641:23332336能力更強的菌株;優(yōu)化樹(shù)干畢赤酵母的培養條件;進(jìn)一步完善4. Dellweg, MRizz, H Methner, et al. D-xylose fermentation by木糖乙醇發(fā)酵工藝。Lett 1984[15JC. Du Preez, M. Bosch and BA.Prior. The fermentation of hexose參考文獻][1張字昊,王頡張偉等半纖維素發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的研究進(jìn)展門(mén)and pentose sugars by candida shehate and pichia stipitis[LMi釀酒科技2004572-74.crobiol. Biotechnol. 1986.23. 228-233.[2mw Jeffries, CP Kurtzman. 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