聚乙二醇修飾水蛭素的分離純化與活性分析

藥物生物技術(shù)302Pharmaceutical Biotechnology 2004,11(5) :302 ~305聚乙二醇修飾水蛭素的分離純化與活性分析于愛(ài)平,蔣中華,鐘根深,董春娜,吳祖澤'(軍事醫學(xué)科學(xué)院放射醫學(xué)研究所,北京100850)摘要用活化的聚乙二醇(PEG)對水蛭素進(jìn)行化學(xué)修飾,質(zhì)譜分析表明,修飾產(chǎn)物是修飾度不同的分子質(zhì)量相差5 000 u的水蛭索的混合物。用離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析對反應產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,離子交換層析難以達到完全分離;而采用凝膠過(guò)濾層析方法可較好地分離修飾度不同的各組份。生物學(xué)活性分析表明,不同的PEG修飾度對水蛭素的活性具有顯著(zhù)影響,連接1~2個(gè)PEG的水蛭素保持了原有活性,而連接3個(gè)PEG的水蛭素活性顯著(zhù)下降。關(guān)鍵詞水蛭素 ;聚乙二醇;化學(xué)修飾;分離純化中圖分類(lèi)號:Q51文獻標識碼:A文章編號: 1005-8915(2004)05 0302-04血栓疾病已成為威脅人類(lèi)健康最嚴重的疾病之物的活性進(jìn)行研究具有重要意義[7.8]。一,在該類(lèi)疾病的治療過(guò)程中,除了使用溶栓藥物采用PEG對水蛭素進(jìn)行化學(xué)修飾,是延長(cháng)其外,通常還需要使用抗凝藥物以提高療效和防止再半衰期降低其免疫原性的有效方法。本研究建立栓塞。凝血酶在血凝系統中參與凝血過(guò)程的共同途了PEG修飾水蛭素的分離純化方法,并對水蛭素徑,水蛭素(hirudin)可通過(guò)與凝血酶的結合直接抑的不同修飾度對其活性的影響作了探討。制凝血酶的活性,從而具有抗凝和抗栓作用,目前被1材料和方法認為是凝血酶最強的抑制劑。水蛭素是一- 種小分子(7ku )的蛋白,在體內的消除半衰期只有1~ 1.1 實(shí)驗材料2 h1.2 ,臨床用藥量較大。此外,連續使用大劑量異mPEG- SPA(分子質(zhì)量5 000 u)購自Shearwater源蛋白,臨床免疫反應常常限制了其有效應用。公司;重組水蛭素I為本實(shí)驗室提供,純度95%以為了提高和改善蛋白和多肽藥物的藥效學(xué)和上;凝膠過(guò)濾介質(zhì)Superdex75和離子交換介質(zhì)藥物動(dòng)力學(xué)特性,采用- - 些化學(xué)材料對藥物分子進(jìn)SourceQ15均購自Pharmacia 公司; TH發(fā)色底物購行化學(xué)修飾是實(shí)現這一目標的重要途徑之一。自Roche公司。其他藥品為分析純。所有水溶液均PEG修飾后的蛋白不容易被蛋白水解酶降解，而用Millipore超純水系統生產(chǎn)的超純水配制。且不容易被腎小球濾過(guò),所以血藥半衰期得以延1.2 mPEG SPA修飾水蛭素的制備長(cháng)3.4]。同時(shí), PEG對蛋白抗原表位的物理屏障作水蛭素溶于pH值9的硼酸緩沖液中,分別按用,可以使蛋白的免疫原性或抗原性下降或消水蛭素:mPEG-SPA摩爾比1:1和1:2的比例稱(chēng)除5]。其中,PEG修飾的腺苷脫胺酶和天冬酰胺取mPEG SPA,室溫攪拌反應1 h。酶已獲批準上市6]。一定種類(lèi)的活化好的PEG對1.3 質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)的特定基團有一定的選擇性,但對某- - 蛋白取水蛭素與mPEG SPA摩爾比為1:2的反應產(chǎn)分子內的多個(gè)相同基團的修飾卻具有隨機性,產(chǎn)物物,質(zhì)譜方法(MALD-TOF-MS)測定產(chǎn)物分子質(zhì)量。因修飾程度和修飾位點(diǎn)的不同而存在不均一-性,產(chǎn)1.4 離子交換層析物的活性也隨之不同。因此，研究PEG修飾后的取水蛭素與mPEG- SPA比例為1:1的反應產(chǎn)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分析與分離方法并對不同修飾度產(chǎn)=X 10 cm),流動(dòng)相A中國煤化工fHCNMHG收稿日期:2003-11-25修回 日期:2004 -01-09基金項目:國家“973”計劃基金(2002CB7 13804)資助作者簡(jiǎn)介:于愛(ài)平,1972年生,女,山東省海陽(yáng)市人,在讀博士生E-mail:yap7020@ sina. com. cn*通訊作者:吳祖澤Tel:010-68158311 E-mail: wuct@nic. bmi. ac. cn于愛(ài)平等;聚乙二醇修飾水蛭素的分離純化與活性分析303液:0.02 mol/L的乙醇胺緩沖液(pH值9.5),B2.2離子交換層析液:0.02 mol/L的乙醇胺緩沖液(pH值9.5)加首先,采用離子交換層析方法對修飾混合物進(jìn)0.5 mol/L的NaCl。0~0. 5 mol/L NaCl線(xiàn)性梯行了分離嘗試，分別取各洗脫峰進(jìn)行SDSPAGE。度洗脫，流速為2 ml/min,檢測波長(cháng)為214 nm。從色譜圖(圖2)和電泳圖(圖3)可以看出,不同修1.5 凝膠過(guò)濾層析飾度的PEG水蛭素的保留時(shí)間存在差異。圖2中取水蛭素與mPEG -SPA比例為1:1的反應產(chǎn)峰1,峰2和峰3分別為接3個(gè),2個(gè)和1個(gè)PEG物上Superdex 75柱(2.6 cmX 90 cm),流動(dòng)相為的水蛭素,峰4和峰5又分別是接2個(gè)和1個(gè)PEG0.05 mol/L的磷酸緩沖液(pH值7.0),流速為的水蛭素。但不同修飾度的PEG-水蛭素仍然難2ml/min,檢測波長(cháng)為214nm。以達到基線(xiàn)分離,通過(guò)改變洗脫條件并沒(méi)有明顯1.6 生物活性測定改善。參照文獻[9]的方法,取凝膠過(guò)濾層析中分得的各組份,按等摩爾數水蛭素測定其生物活性。31.7 蛋白凝膠電泳(SDS-PAGE方法)按文獻[10]方法進(jìn)行,采用氯化鋇和碘液對PEG進(jìn)行染色,水洗后再對蛋白進(jìn)行考馬斯亮藍染色。2.結果2.1 反應產(chǎn)物分子質(zhì)量6120 180 240 300 360Elution volume(m)由質(zhì)譜圖(圖1)可看出,連接產(chǎn)物中有5種成分,其分子質(zhì)量依次相差5 000 u左右,該分子質(zhì)量Fig2 Chromatograph of PEGylated hirudin isolated withanionrexchange chromatography之差與所用PEG分子質(zhì)量-致,由此可知,分子質(zhì)量由小到大分別對應于水蛭素和連接1,2,3,4個(gè)123PEG的水蛭素(分別記為水蛭素、PEG1-水蛭素、PEG2水蛭素、PEG3-水蛭素和PEG4-水蛭素)。因此,PEG修飾水蛭素的產(chǎn)物是不同修飾度產(chǎn)物的混合物。采用HPLC分析各修飾組份的百分比,其中PEG1-水蛭素、PEG2水蛭素、PEG3-水蛭素和PEG4-水蛭素百分比分別為10.1%, 32. 1%，42. 4%和15. 4%。為此,進(jìn)-一步對該混合物進(jìn)行了分離純化，為使各修飾度產(chǎn)物得到有效分離,選Lane 1. Protein markers; Lane 2. PEG-hirudin; Lane 3. Hirudin;擇水蛭素與mPEG SPA摩爾比1:1的反應產(chǎn)物進(jìn)Lane4 , 5. Peak1 and peak2; Lane6●7. Peak3; lane8，9. Peak4and peak5行分離純化。Fig 3 SDS-PAGE of fractions isolated with anion-ex-change chromatography4500 600240002.3凝膠過(guò)濾層析3900因反應產(chǎn)物之間分子質(zhì)量相差5 000 u,因此,12371 178692500嘗試采用凝膠過(guò)濾方法分離。從圖4可見(jiàn),各組份2000之間達到了較好分離。各洗脫峰SDS-PAGE結果:1S00 .1000見(jiàn)圖5中國煤化工別是PEG3-水蛭s00素、PEMHCNMH Gg,峰4是反應中5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000剩余的水蛭素,峰5在電泳中表明是非蛋白類(lèi)成Fig 1 MALDI-TOF mass spectrum of PEGylated hirudin分,且無(wú)抑制凝血酶的活性,可能是反應中產(chǎn)生的304藥物生物技術(shù)第11卷第5期琥珀酰亞胺等小分子。PEG1-水蛭素,但在較低鹽濃度時(shí), PEG3-水蛭素,PEG2-水蛭素和PEG1-水蛭素不能得到完全分離。這是因為,一-方面,不同修飾度水蛭素的電離常數的改變較小;另一方面,由于PEG連接位點(diǎn)的不同,連接相同數目PEG的水蛭素的同分異構體在1離子交換層析中的色譜行為不同(數據另文報道)，因而連接位點(diǎn)不同而形成的同分異構體是導致各組份間分離困難的重要原因之- _叫。 .20406080100120140160.作者采用凝膠過(guò)濾層析分離PEG-水蛭素,避Elution time(min)開(kāi)同分異構體造成的困難,各組份得到了有效分Fig 4 Chromatograph of gel filtration of PEGylated hirur離,并且小批量制備了3批產(chǎn)品,分析了各組份的din生物活性,證明接1個(gè)和2個(gè)PEG分子不影響水6蛭素活性,而接3個(gè)PEG使其活性大大下降。其原因可能有兩方面:一是接3個(gè)PEG后,對水蛭素活性有較大影響的賴(lài)氨酸被修飾,引起水蛭素活性下降。有研究表明,水蛭素47位賴(lài)氨酸(Lys47)對維持水蛭素穩定的空間構象具有重要意義[2]。其側鏈氨基被PEG修飾后,可影響與其它氨基酸;的相互作用,水蛭素空間結構可能發(fā)生改變或不穩定導致活性下降;另-方面原因可能是多接1個(gè)PEG后造成PEG對水蛭素的空間屏蔽作用,使其Lanel. Protein markers; lane2. Hirudin; lane3. PEG hirudin; lane4活性區無(wú)法與凝血酶相互作用，表現為生物活性下~6. Fraction from peak3,2,1 respectively降。該分離純化方法比較穩定,可以放大適應工業(yè)Fig5 SDS-PAGE of fractions isolated with gel filtration化生產(chǎn)的需求。同時(shí),優(yōu)化PEG對水蛭素的修飾2.4生 物活性測定反應條件,提高PEG1水蛭素和PEG2-水蛭素的生物活性測定結果見(jiàn)表1。轉化率、降低PEG3-水蛭素的產(chǎn)率具有重要意義。Tab 1 The specific activity of hirudin and PEGylated hiru-參考文獻[1] SchenkJ F, Glusa E, Radziwon P, et al . A recombinant hir-Fractions .Specific activity(ATU/mg hirudin)udin( IK HIRO2) in healthy volunteers. Effects on coagula-PEG3- hirudin5850tion parameters and bleeding time[J]. Haemostasis, 1996,26:PEG2- hirudin17908140.PEG1-hirudin17300_2] Zoldhelyi P, Webster MWI, Fuster V, et al. RecombinantHirudin17454hirudin in patients with chronic, stable coronary artery diae-ase. Safty, hl-life and efet on coagulation parameters[J].由表1可看出,當連接1個(gè)和2個(gè)PEG時(shí),水Circulation, 1993,88:2015.蛭素的生物活性不受影響，而當接3個(gè)PEG時(shí),其[3] Saier MG, Somack R, Wliliamns L D. Plasma cerne and活性大大下降。immunological properties of long-acting superoxide dismutaseprepared yusing 35000 to 120000 dalton by poly-ethylene gly-3討論中國煤化工i.l1966377.用離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析對PEG修飾[4]YHC N M H GI, et al. Prolongation ofthe serum half-life period of superoxide dismutase by poly的水蛭素進(jìn)行分離純化。雖然離子交換層析中,在(ethylene glycol) modification[J]. J Control Release , 1997,較高鹽濃度時(shí)，可以得到較純的PEG2-水蛭素和46:253. .于愛(ài)平等:聚乙二醇修飾水蛭素的分離純化與活性分析305[5] Katre N V. Immunogenicity of recombinant IL-2 modified by9] Grie bach U, St rzebecher J, Markwardt F. Assay of hirudincovalent attachment of polyethylene glycol[J]. J Immunol,in plasma using a chromogenic thrombin substrate [J].1990, 144:209.Thromb Res,1985,37:347.[6] Veronese F M,Harris J M. Introduction and overview of pep-[10] Kurf rst M M. Detection and molecular weight determinationtide and protein pegylation[J]. 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J Mol Biol , 1991,221:583.Isolation of PEGylated Hirudin and Analysis on It's ActivityYU Ai-ping, JIANG Zhong hua, ZHONG Gen-shen, DONG Chun-na, W∪Zu-ze(Institute of Radiation Medicine ,Academy of Military Medical Sciences , Beijing 100850,China)Abstract Hirudin was modified by activated polyethylene glycol ( PEG). Matrix- assisted laser desorp-tion ionization time of flight mass spectrometry(MOLDI-TOF-MS) determination indicated that the at-tachment of PEG produced a heterogeneous mixture of hirudin that differed by 5 000 U. Ion exchangechromatography and gel filtration were applied to isolate the products. Purified products by gel filtrationwere obtained and the activity was analyzed. The activity of hirudin linked with 1~2 PEG chains keptintact but that of hirudin linked with 3 PEG decreased markedly.Key words Hirudin, Polyethylene glycol, Chemical modification, Isolation《中國藥物濫用防治雜志》2005年征訂啟事《中國藥物濫用防治雜志>是經(jīng)國家科學(xué)技術(shù)部批準、由衛生部主管、中國藥物濫用防治協(xié)會(huì )、寧波戒毒研究中心主辦的我國在藥物濫用防治領(lǐng)域進(jìn)行報道和交流的學(xué)術(shù)性期刊,《中國藥物濫用防治雜志》的出版發(fā)行,將為進(jìn)一步推動(dòng)我國藥物濫用防治工作及對藥物濫用的預防、宣傳、教育發(fā)揮積極作用。該刊于1995年創(chuàng )刊,刊號為:CN11-3742/R,雙月刊,大16開(kāi)本,64頁(yè),國內外公開(kāi)發(fā)行,郵發(fā)代號:82 -768。<中國藥物濫用防治雜志>設有法規、論著(zhù)、綜述、專(zhuān)題講座、專(zhuān)論述評、論壇、臨床報道、案例報道、基層園地及其他等欄目。面向全國醫療衛生、公安、部隊等戒毒機構,社會(huì )醫學(xué)及健康教育研究、宣傳單位,各級衛生行政管理機構及大中專(zhuān)醫學(xué)院校?！吨袊幬餅E用防治雜志>2005年全年訂價(jià)48元。歡迎單位和個(gè)人在當地郵局或中國藥物濫用防治雜志社訂閱。郵局匯款:中國煤化工郵編:100061單位:中國藥物濫用防治雜志社MYHCNMHG地址:北京市崇文區法華南里11號樓中國藥物濫用防治雜志社電話(huà):(010)67157648 61757647 傳 真:(010)67157648