花色改造基因工程

中國生物工程雜志第23卷第7期CHINA BIOTECHNOLOGY2003年7月花色改造基因工程李洪清!∵”李美茹2潘小平2陳貽竹Q4、a18A(1華南師范大學(xué)生命科學(xué)院廣州510312中國科學(xué)院華南植物研究所廣州510650)摘要自1987年世界首例成功運用轉基因技術(shù)改造矮牽?；ㄉ詠?lái),花色改造基因工程技術(shù)不斷展現它在培育新花色品系上的無(wú)窮魅力。介紹了近年來(lái)運用基因工程技術(shù)成功改逵花色的3種主要策略:(1)采用反義RNA及共抑制的方法來(lái)改變花顏色的深淺;(2)通過(guò)導入新基因產(chǎn)生新奇花色;(3)利用轉座子構建特殊表達載體隨機激活花色合成的基因來(lái)產(chǎn)生嵌合花色。此外,還對轉基因株花色不穩定原因進(jìn)行了討論。關(guān)鍵詞花色花色素苷基因工程花是觀(guān)賞植物的主要觀(guān)賞器官。自然界花色與內源的互補mRNA結合,使mRNA不能合成蛋白種類(lèi)繁多,但一些重要花卉的色彩不全,如月季、郁質(zhì),以此達到抑制靶基因表達和修飾目標性狀的目金香、康乃馨缺少藍色和紫色;非洲紫羅蘭、仙客的,從而實(shí)現花色的改變。1988年, van der Krol來(lái)、天竺葵矮牽牛缺少純黃色;鳶尾、紫羅蘭等缺等首先采用此法獲得了矮牽?；ㄉ儺愋缕贩N少紅色和磚紅色,這些是運用傳統雜交育種方法無(wú)他們將編碼查爾酮合成酶( chalcone synthase,CHS)法解決的問(wèn)題。因此,對花色基因的研究具有重要的結構基因反向導入矮牽牛植株,轉基因株的花色意義,一方面使人們有可能對花色進(jìn)行人工修飾,由紫色變成白色,且不同株系表現出不同程式的花進(jìn)一步提高其觀(guān)賞和商品價(jià)值;另一方面,由于花色變異。Ada等2分別將反義DFR( dihydroflavonol色的明顯可見(jiàn)性,花色基因可作為看得見(jiàn)的標記基4 - reductase)和CHs導入藍豬耳中,轉基因株系的因,用于研究基因的表達、調控等?；ü诨ㄉ剀蘸烤什煌潭鹊臏p少,結果產(chǎn)花色素苷是影響花色的主要色素,控制花從紅多種新花色圖案,如花冠檐上深著(zhù)色部分呈波浪形色至紫色、藍色的一系列變化,其含量的增高或降或某些唇瓣著(zhù)色較深。轉反義CHS的株系,花筒低都可能改變花的顏色。目前對屬于類(lèi)黃酮的花和花冠檐的花青素色苷均同等程度減少,花色趨色素苷的合成代謝以及與之相關(guān)的基因研究得較紅;而轉DFR基因株系冠檐的花色素苷含量減少為深入,而且已被應用于改造花色的實(shí)驗中。下面程度比冠筒的大,轉化株積累了大量的黃酮、黃酮介紹成功地進(jìn)行花色改造的基因工程技術(shù)和成果。醇物質(zhì),因而轉化株的花色顯得更藍。一般而言,采用反義RNA技術(shù)轉化結構基因,均在不同程度1花色變淡上減少花青素苷的含量,花色也相應地變淡。該方導入植物內源色素基因的反義( antisense)基因法也已成功地應用于改造其它多種花色上3或正義( sense)基因,抑制內源色素基因的活性,造1.2共抑制法( sense suppression或 cosuppression)成無(wú)色底物的積累,使花色變淡或變白。即通過(guò)導人一個(gè)(或幾個(gè))與內源基因同源或1.1反義RNA技術(shù)( antisense suppression)異源(但序列應與內源基因具高度同源)的基因,達將某一基因反向插入植物表達載體,然后導人到抑制該內源基因轉錄產(chǎn)物的積累,進(jìn)而抑制該內植物體內,這種“錯誤”的DNA轉錄成RNA之后,源基因表達的技術(shù)。共抑制現象是1990年在Jorgenson教授實(shí)驗室發(fā)現的,他們本想將CHS導收稿日期:200207-28修回日期:200305-19入矮牽牛,通過(guò)CHS在細胞中的超表達國家自然科學(xué)基金資助項目(30170667),全國100篇優(yōu)秀博士文作者與專(zhuān)項基金資助項目mYH中國煤化工實(shí)驗結果出乎他,電子信箱:hqgi@senu,ehu,cn成受到抑制,42%CNMHG第7期李洪清等:花色改造基因工程的轉化株產(chǎn)生完全白花和紫白嵌合花。但轉化株有的基因導入其中,從而使該受體植物增加一個(gè)或花色的遺傳不穩定?，F在共抑制現象已在多種植幾個(gè)新的性狀。將該原理應用于花色基因工程操物上發(fā)現并應用于基因功能、基因活性網(wǎng)絡(luò )調控的作上,可以產(chǎn)生新奇花色。DFR分別將香橙素研究上。Aida等分別將DFR和CHS導入藍豬耳( dihydrokaempferol DHK)、雙氫槲皮素中,轉基因株系的花冠花色素苷含量均呈不同程度( dihydroquercetin)、雙氫楊梅樹(shù)皮素的減少,位于花筒的花色素苷含量減少程度大于花( dihydromyricetin)還原成相應的白天竺葵苷元冠檐花筒的顏色幾近白色。發(fā)生共抑制與導入基( leucopelargonidin)、白矢車(chē)菊苷元(ooin)和因的拷貝數以及2個(gè)基因之間的同源性程度密切白飛燕草苷元( (leucodelphinidin)這些都是花青素相關(guān)M。在矮牽牛的花冠組織中有2個(gè)CBS基的前體。矮牽牛的DFR不能將DHK作為底物,只因:CHSA的mRNA約占90%,CHSJ的占10%,這對雙氫楊梅樹(shù)皮素有還原作用。因此,在矮牽牛兩個(gè)基因在編碼區處具85%的同源性。導人中,存在有花青素和翠雀素的衍生物,但缺少天竺CHSA編碼區的開(kāi)白花的矮牽牛中不僅CHSA被葵的衍生物。矮牽牛突變種RI01積累大量DIK抑制而且CHSJ也被抑制。這說(shuō)明產(chǎn)生共抑制并m和雙隱性,缺少F3H活性,只有極低的不需要2個(gè)基因序列完全相同。菊花的CBS和}35H活性,含極少量的花青素和花翠素衍生物,DFR基因與矮牽牛的具70%的同源性。當將來(lái)源無(wú)天竺葵青的衍生物,花近白色。玉米編碼DFR于矮牽牛的CHS導入矮牽牛中,48個(gè)轉化株中有基因A能將雙氫槲皮素催化成花青素衍生物。8株出現共抑制現象,而換成來(lái)源于菊花的CHSMeyer等將A基因導入R01中,轉化株積累了則在調查的97株轉化株中,沒(méi)有發(fā)現有共抑制的天竺葵糖苷,沒(méi)有DHK,花為磚紅色。這也說(shuō)明了現象。改用DFR也得到同樣的實(shí)驗結果。轉化來(lái)源于玉米的A基因編碼的DFR酶不象矮牽牛牽牛的西A基因導人矮牽牛W80和W85后,不同的DR酶樣,對底物極其專(zhuān)一。但以上獲得的品種的轉化株花色改變程式不同,發(fā)生在W85株轉化花顏色極不穩定,最終花呈多種顏色,如白系中的嵌合花色更多。最近, Shimada等m將矮牽色、雜色和紅色。Elma等比較了來(lái)源A基因牛的FySH基因導入細胞中存有F35H基因的和非洲菊DFR(g4)基因在RL0中的表達情況矮牽牛(vars. Falcon Blue, Cascade Royal,花為深藍發(fā)現轉A1基因的植株花顏色較淡,且隨生長(cháng)發(fā)育色)中,發(fā)現轉基因植株的花為淡藍、淡紅色,推測時(shí)間發(fā)生變化,這與導人RL0多拷貝基因和35S這是由于外源基因與內源基因通過(guò)共抑制,降低或啟動(dòng)子和 AI cDNA發(fā)生甲基化有關(guān)。轉剛基因抑制了F35H基因的表達引起的。的植株,花色澤深且穩定,這與 gdfr cDNA中GC含反義RNA技術(shù)和共抑制技術(shù)在改變花色顯現量低,不易發(fā)生甲基化有關(guān)。 Davies等田將苜蓿上有明顯的區別。 Jorgensen等比較了轉反義CHR( chalcone reductase導人矮牽牛,發(fā)現轉化株花CHS和正義CHS矮牽牛株系花顏色的變化,發(fā)現的顏色從白色變?yōu)辄S色,這是因為轉化株中積累了轉反義CHS僅影響花冠的顏色,但轉正義CHBS不大量6脫氧查爾酮的緣故。轉辣椒紅素合成酶基僅影響了花冠的顏色,而且影響了花藥、莖和葉的因的煙草植株葉片中由于積累辣椒紅而呈紅顏色,特別是影響了花簡(jiǎn)的顏色。兩者所產(chǎn)生的新色。來(lái)源于單細胞綠藻 Haematococcus pluvialis花色圖案也不同,導入反義CHS產(chǎn)生白色區,白色的編碼P胡蘿卜素酮酶基因,被定向導人煙草蜜腺區域從花筒幅射到冠檐,而導入正義CES的株系,組織后改變了轉化株胡蘿卜素生物合成的途徑,則在冠檐上產(chǎn)生白色的楔形或波浪形。Aida等在蜜腺組織中產(chǎn)生了蝦青素該組織的顏色也相應在藍豬耳上也觀(guān)察到了同樣的現象,即轉正義CHS地從黃色變?yōu)榧t色?；駾FR顯著(zhù)減少了花色素苷在花筒的積累。這同理論上可以通過(guò)超表達某一結構基因,以增強時(shí)也說(shuō)明了相同基因在矮牽牛和藍豬耳上發(fā)生共原有代謝產(chǎn)物的表達,達到加深花器官花色素苷的抑制的部分機理是相同的。含量。但目前該方法在改造花色研究中尚無(wú)成功增加新花色的報道。結構基因的活性由調節基因控制,目前已中國煤化工當植物組織由于缺將欲修飾的供試株及其近緣種植物中原先沒(méi)TH一舌結構基因時(shí),可以CNMHG中國生物工程雜志第23卷通過(guò)導入調節基因來(lái)改變花色。Loyd等6將玉米影響的目的基因是與花色素合成有關(guān)的結構基因的調節基因R和C導入擬南芥和煙草中,2種植物或調節基因時(shí)則不同細胞中的結構基因表達的時(shí)的轉化株花色均由白色變?yōu)椴煌顪\的粉紅色空不同,因而在不同細胞中生成的花色素苷不同,在觀(guān)賞植物中,花卉的藍色品系非常罕見(jiàn),尤導致在同一花瓣上可能顯現不同的顏色,形成美麗其是那些名貴花卉,如月季、百合、郁金香、香石竹、的嵌合花色。例如,在構建玉米Lc基因的表達載菊花等均缺乏藍色的品種。人們期望將編碼F35′體時(shí),在lc基因編碼區和CMv35s啟動(dòng)子之間插H基因引入缺乏F35H基因的玫瑰、香石竹中,使轉座子Ac,轉化番茄,由于A(yíng)c跳出之后,Lc基因原合成花葵素苷和花青素苷的代謝方向轉向翠雀的表達導致在番茄的葉子和果實(shí)上產(chǎn)生深紅色的素糖苷的合成方向,從而使花變?yōu)樗{色花。斑點(diǎn)。2001年Liu等首次構建了一個(gè)轉錄因florigene公司將矮牽牛的F35H基因和D基因子R的表達載體,在啟動(dòng)子CaMV35s和R基因之導入白花的康乃肇中,轉化株積累了大量的花翠間插入一個(gè)來(lái)源于擬南芥自主性的轉座子Tagl,R素,花色也因而發(fā)生了改變,改變程度與導入的基基因調節花色素苷合成途徑中的多個(gè)結構基因(如因的表達強度相關(guān)。該公司現已得到2個(gè)商品的CHS、DFR、UFGT、F3H、CH等)的表達。實(shí)驗表品系,分別為 Moondust"(花為淡紫色)和明轉基因的煙草的花產(chǎn)生多種美麗的嵌合花色。Moonshadow(深紫色),先后在1996年和1997年投放到市場(chǎng)。最近該公司報道將F35H基因和4問(wèn)題與展望CyTP65基因同時(shí)導入康乃馨中,花色從原來(lái)對照雖然第一例利用基因工程技術(shù)改造花色的實(shí)株的紅色轉變?yōu)樯钭仙?。但細胞中含有高含量的驗誕生于1987年,距今已有10多年,在這段時(shí)間花翠素并不意味著(zhù)花瓣就能呈現理想的藍色,里已在多種植物上成功地進(jìn)行了花色基因工程技Shimada等將來(lái)源于龍膽的F35H的cDNA術(shù)操作,但至今我們仍難隨心所欲地控制花色。究7G1導入開(kāi)粉紅色花的煙草( Nicotiana tabacum cv.其原因,主要是因為花色的形成受多種因素的影Petit Havana srl,該植物缺少F35H酶),同時(shí)還將響例如,在一些植物中藍顏色是翠雀素與適當的來(lái)源于矮牽牛的F35H酶的cDNA—AK4導入因素如助色素、金屬復合物、液泡pH值等相互作矮牽牛(var.Flon,該植物缺少F3'5'H酶,花呈粉用而產(chǎn)生)。這就是為什么雖然最早分離轉化紅色)中,轉化株均積累了花翠素的衍生物,花色從F3,5H基因,進(jìn)行培育藍色月季的研究始于1993粉紅變?yōu)檠蠹t,在所有的轉化株中均沒(méi)有藍色的年,但至今還未有成功培育藍色月季報道的原因?；??；ù渌氐暮吭谵D基因的矮牽牛中遠高于在 Forkmann2)將影響花色顯現的有關(guān)花色基因分為轉基因的煙草中。在轉基因的矮牽牛中,花色圖案以下幾類(lèi):(1)控制黃酮類(lèi)生物合成單個(gè)步驟的基也發(fā)生了變化,出現新的星型圖案。藍色花的形成因;(2)與黃酮類(lèi)修飾有關(guān)的基因;(3)開(kāi)關(guān)全部或除與液泡中的色素有關(guān)外還與助色素、金屬離子、部分合成途徑的調節基因;(4)影響黃酮類(lèi)濃度的液泡的pH值密切相關(guān),人們正在從影響藍色花形基因(增強或減弱色素合成;阻止色素積累;引起酶成的諸多因素中找到培育藍色玫瑰等花卉的突破促或化學(xué)褪色);(5)與花朵特定結構有關(guān)的基因(花瓣特定部位色素不同的產(chǎn)生或積累,花嵌合體3嵌合花色的形成;轉座子引起的基因不穩定表達);(6)影響花色的基因或因子(共著(zhù)色;黃酮類(lèi)與金屬離子的嵌合花色具有很高的觀(guān)賞和商業(yè)價(jià)值,自然界互作;液泡pH值);(7)控制花瓣毛、乳突、色素細胞中部分嵌合花色是由于轉座子引起的。利用轉座的形狀和分布、角質(zhì)層類(lèi)型等形態(tài)特征的基因2。子插入法可一次獲得較多種類(lèi)的突變體,例如van因此,也許隨意操作以上花色基因的表達,將影響Houwelingen等利用內源轉座子(TEs)插入矮牽著(zhù)花顏色的表達。牛,獲得55個(gè)新的花色突變體。轉座子通過(guò)插入目前我們對于3大類(lèi)色素生物合成途徑產(chǎn)生或割離目的基因而關(guān)閉或恢復基因的表達活性。色素變化的認識仍然有限,花顏色形成過(guò)程的調控由于不同細胞中轉座子跳出的時(shí)間不同,因而不同很復細胞中的目的基因的表達時(shí)空不同,如果被轉座子在植中國煤化工與。而且轉基因沉默等)很難控CNMHG第7期李洪清等:花色改造基因工程制,這可能是迄今為止所進(jìn)行的改變花色的遺傳操Plant Mol Bio, 1996. 957-973作存在不穩定性的原因所在。實(shí)驗表明轉轉錄因[9 I Huits H S M. 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Chen Yiahu'(1 College of Life Sciences, South China Normal University Guangzhou 5106312 South China Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences Guangzhou 510650)Abstract The first novel colored flowers of Petunia in the world were obtained by genetic engineering in 1987Since then, different methods were developed for flower color manipulation. The three effective methods successfullyed in developing novel colors were reviewed: changing flower colors by anti-sense and sense suppression technologycreating novel flower color by expression of new foreign genes; making variegated flower color by random activation ofanthocyanin gene expression through transposon strategy. Finally, the problems and perspectives of genetic engineering offlower color were discussedKey words Flower color Anthocyanin Genetic engineering Transponson耐高溫消毒pH電極和D(溶解氧)電極耐高溫消毒 GKFpH電極和DO(溶解氧)電極是我所科技項目成果產(chǎn)品,pH電極曾獲得“七五”攻關(guān)重大科技成果獎、中國科學(xué)院科技進(jìn)步二等獎,廣泛應用于制藥、生化制品、味精、食品發(fā)酵、石油、血制品、化工等行業(yè)的在線(xiàn)檢測能適時(shí)掌握生產(chǎn)過(guò)程中pH、DO參數的變化,是提高產(chǎn)品質(zhì)量、產(chǎn)量的重要手段pH電極和二次儀表經(jīng)上海技術(shù)監督局和化工部化工專(zhuān)用儀器儀表質(zhì)量監督檢驗中心隨機檢測,結果表明,該產(chǎn)品性能指標和產(chǎn)品質(zhì)量?jì)?yōu)良。通過(guò)幾代申?yáng)|人的奮斗,目前產(chǎn)品質(zhì)量更盡善盡美。主要技術(shù)指標1.pH電極測量范圍:pH-12滅菌溫度:105~150℃測量范圍:10~95℃插人深度:125,150,180,200,250mm(可根據客戶(hù)要求特制)安裝方式:通過(guò)護套與發(fā)酵罐連接或通過(guò)法蘭與反應釜連接,配套工業(yè)pH計,測量范圍分辨率:pH0.01輸出信號:0~10mA或4~20mA標準電流開(kāi)口尺寸:138mmx138mm(表盤(pán))在非機械損傷條件下,玻璃電極壽命長(cháng)于20批罐(滅菌條件130℃,30min)2.DO電極檢測系統:原電池測量范圍:0%-100%響應時(shí)間:90%響應小于760s滅菌條件:120~130℃,0.17MPa二次表輸出信號:0~10mA或4~20mA我廠(chǎng)生產(chǎn)的pH電極和DO電極品種齊全,能與各種規格發(fā)酵罐和反應釜配合使用,能應用于各種場(chǎng)合各種介質(zhì),幾何尺寸采用國際統一規格,能與進(jìn)口產(chǎn)品替換,也可根據用戶(hù)要求特制。制造計量器具許可證編號:滬制0240122上海申?yáng)|生化傳感器廠(chǎng)聯(lián)系地址:上海市定西路1295號中科院上海硅酸鹽研究所郵編:200050聯(lián)系人:任國鑫丁曉聰中國煤化工電話(huà):(021)62208693手機:13901821285傳真CNMHG