聚乙二醇活化酯修飾重組人白細胞介素-2

廣東技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報2006年第4期Joumal of Guangdong Polytechnie Nornal UniversityNo. 4, 2006聚乙二醇活化酯修飾重組人白細胞介素-2鄒險峰張煥楊叢飛于中民(吉林大學(xué)生命科學(xué)院,長(cháng)春130023; 長(cháng)春長(cháng)生基因藥業(yè)公司,長(cháng)春130061)摘要:目的 研究單甲氧聚乙二醇三聚氯氰(Methoxypolyethylene Clycol activated with ecyanunie choride ,Cc - mPEG)和單甲氧聚乙二醇硝基苯基碳酸鹽(Methoxypolyethylene Glycol p - nitrophenyl carbonate, NC - mPEG)兩種PEG活化酯修飾重組人白細胞介素- 2(hIL.-2)的修飾條件和修飾后的性質(zhì)。方法在不同反應條件下用CTLL-2細胞/MTT法測定rhlL-2修飾后的生物學(xué)活性。結果隨著(zhù)PEG活化酯的摩爾比提高,修飾率增加,用CC-mPEG修飾rhlL-2后生物學(xué)活性損失很大，PEG400的加入可以降低CC- mPEG的投料摩爾比; NC-mPEG修飾的rhlL.-2后生物學(xué)活性基本保關(guān)鍵詞:重組人白細胞介素-2;聚乙二醇活化酯;化學(xué)修飾中圖分類(lèi)號:Q 815文獻標識碼:A文章編號: 1672- 423X(2006)04- 0119- 03人白細胞介素- 2是機體免疫調節網(wǎng)絡(luò )中的核心CTL-2細胞由長(cháng)春長(cháng)生基因藥業(yè)公司提供物質(zhì)，在臨床上主要用于治療和輔助治療各種惡性腫1.3 儀器瘤和感染性疾病。重組人白細胞介素- 2不具有天然PAC3000型電泳儀, Bio- rad公司; GS- -700 型掃人白細胞介素- 2的糖基化結構，有免疫原性,大劑量描分析儀, Bio- rad公司;RC03000型CO,培養箱,美國使用易產(chǎn)生抗原抗體反應,而且體內半衰期短,溶解度REVCO公司;190型酶標儀,美國分子生物公司。差,這些限制了它的臨床應用“"。聚乙二醇(polyethylene二、方法glycol, PEG)是-種無(wú)毒、親水、中性的多聚物,聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)可以降低免疫原性、延長(cháng)生物半衰期及2.1rhlL-2和CC-mPEG投料摩爾比對修飾提高水溶性2。在70年代末，國外開(kāi)始了聚乙二醇化產(chǎn)物的影響: 二者的摩爾比分別為1: 10、1:40、1: 80,藥物的研究熱潮，目前已有多種藥物進(jìn)人臨床研究或反應lhr后,8%冰醋酸終止反應，取樣SDS-PAGE非上市，其中羅氏公司的聚乙二醇化干擾素a2a(派羅還原電泳 ,并測定其生物學(xué)活性。欣)也已經(jīng)在我國上市。本研究采用單甲氧聚乙二醇三2.21% 的PEC4000的加入對CC - mPEG修飾聚氯氰(CC - mPEG)和單甲氧聚乙二醇硝基苯基碳酸rhIL- 2的影響:于rhIL- 2溶液加入1%的PEG4000,鹽(NC - mPEG)兩種PEG活化酯修飾rhlL-2,對修飾rhlL- 2和MPEG - CC的摩爾比分別為1:3、1:5.1: 10,條件進(jìn)行了優(yōu)化,并對修飾結果進(jìn)行了分析。反應Ihr后,8%冰醋酸終止反應,取樣SDS-PAGE非還原電泳,并測定其生物學(xué)活性。一、實(shí)驗材料2.3rhIL-2和NC-mPEG投料摩爾比對修飾1.1 原料和藥品.產(chǎn)物的影響:二者的摩爾比分別為1: 10、1:20、1:40,反hlL- 2半成品為長(cháng)生基因藥業(yè)公司提供;單甲氧應lhr后,8%冰醋酸終止反應,取樣SDS-PAGE非還聚乙二醇三聚氯氰(CC - mPEG)和單甲氧聚乙二醇硝原電泳，并測定其生物學(xué)活性?；交妓猁}(NC - mPEG) (MW = 5000)及PEG - 40002.4rhlL-2和NC-mPEG反應時(shí)間對修飾產(chǎn)(分析純)購于Sigma 公司;低分子量電泳標準蛋白物的影響:于hlL.- 2溶液中按1: 30 摩爾比加入(Phamacia公司) ;其余藥品試劑均為分析純。MPEC中國煤化工2h、12h, 8%冰醋酸終1.2 細胞株止反|YHCNMHG電泳,并測定其生物收稿日期:2005- 12-02作者簡(jiǎn)介:鄒險峰(1971-),男,吉林省長(cháng)春市人,吉林大學(xué)生命科學(xué)院博士,從事生化藥學(xué)和酶學(xué)研究?！?20.鄒險峰:聚乙二醇活化酯修飾重組人白細胞介素-2第4期學(xué)活性。2.5生 物學(xué)活性的測定:采用thlL- 2依賴(lài)細胞株CTLL- 2細胞/ MTT法咧，用國家標準品校準確定(IU)。.45三、結果3.1隨著(zhù) CC - mPEG(MW5000)投料摩爾比的增圖3 thL-2與 NC- mPEG不同摩爾比的修飾產(chǎn)物SDS -PACEI,hlL- 2;2,標準蛋白;3,4,5, hlL- 2與NC - mPEG的摩加，修飾產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量增加，當rilL-2與CC-爾比分別為1:10, 1:20, 1:40.mPEG摩爾比為1: 10時(shí),修飾率很低;當二者摩爾比提3.4隨著(zhù) NC- mPEG( MW5000)投料摩爾比的固高到1: 40時(shí),基本修飾完全,修飾產(chǎn)物主要為兩分子定,延長(cháng)反應時(shí)間從1小時(shí)到12小時(shí),修飾率提高,但PEG的修飾物和四分子PEG的修飾物兩者修飾產(chǎn)物，產(chǎn)物有大分子多聚物轉化的趨勢,見(jiàn)圖4。但是活力回收很低;提高摩爾比到1: 80時(shí),修飾產(chǎn)物主要為大分子多聚物，活力幾乎完全喪失,見(jiàn)圖1。970006600045000300002010014400圖4不同反應時(shí)間的 NC - mPEG修飾產(chǎn)物SDS- PAGE1,標準蛋白;2,3,4,反應時(shí)間分別為1h, 2h, 12h圖1thL-2與CC-mPEG不同摩爾比的修飾產(chǎn)物SDS-3.5采用CC- mPEG(MW5000)修飾rhlL-2,修PAGE1,2,3, rhlL-2與CC - mPEG的摩爾比分別為1: 80, 1:40,飾后生物學(xué)活性下降很多，從修飾前的總活力為1: 10;4,標準蛋白;5.,hlL.-2.3.2隨著(zhù) 1%PEG4000的加人，可以大大降低6.08X 10'下降到6.55X 10*; 而采用NC - mPEGCC - mPEG(MW5000)投料摩爾比。當thlL-2與CC-(MW5000)修飾rhIL- 2,修飾后生物學(xué)活性基本保留，mPEG摩爾比為1: 10時(shí),基本修飾完全,見(jiàn)圖2。但活從修飾前的總活力為6.75x 10'下降到6.60X 10’。力損失很大,而且修飾物極不穩定,很快就完全喪失活討論rhIL- 2是由133個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，相對力。分子量為15000- 17000道爾頓,屬于小分子蛋白質(zhì),有3個(gè)半胱氨酸殘基,分別位于第58位、105 位、125 位,三第58位和第105 位半胱氨酸殘基形成二硫鍵。這樣IL- 2才具有折疊結構，才能表現出生物學(xué)活性(4|rhIL-2分子還包含11個(gè)賴(lài)氨酸,應用PEG與rhIL- 2的非必需基團-賴(lài)氨酸殘基的自由氨基共價(jià)結合，可提高蛋白的相對分子質(zhì)量,延長(cháng)半衰期,同時(shí)由于PEG圖2 rlL.-2 與CC - mPEG不同摩爾比(含1%PEG4000)的修分子的屏障作用，降低免疫原性和酶解幾率。飾產(chǎn)物SDS- PAGEI, 2, 3, rhll- 2與CC - mPEG的摩爾比分別研究表明，PEG活化酯和rhL-2的投料摩爾比為1: l0,1:5, 1:3;4,hlL-2; 5,標準蛋白.是影響修飾反應的關(guān)鍵因素。無(wú)論CC - mPEG還是3.3隨著(zhù) NC - mPEG(MW5000)投料摩爾比的增NC - mPEG,隨著(zhù)PEG活化酯投料摩爾比的增加,修飾加,修飾產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量增加，當thIL-2與CC-率提中國煤化工量增加。CC-mPEG修mPEG摩爾比為1:10時(shí),修飾率很低;當二者摩爾比提飾 t|YHCNM H G很多,而且產(chǎn)物極不穩高到1:20時(shí),產(chǎn)物主要為兩分子PEG的修飾物,活力定; NC - mPEG修飾hlL.- 2后生物學(xué)活性基本不變，幾乎完全保留;提高摩爾比到1: 40時(shí)，修飾產(chǎn)物成分而且產(chǎn)物比較穩定。究其原因,可能是thlL- 2分子包較多,見(jiàn)圖3。含的11個(gè)賴(lài)氨酸殘基的自由氨基有的在分子表面，這.第4期鄒險峰:聚乙二醇活化酯修飾重組人白細胞介- 2些自由氨基經(jīng)PEC修飾后不會(huì )影響到thlL-2分子的投料摩爾比下 反應1小時(shí)修飾率已經(jīng)很高，修飾后生生物學(xué)活性，但如果PEG修飾的是hIL-2分子內部物學(xué)活性基本保留，說(shuō)明NC - mPEG首先修飾的是的賴(lài)氨酸自由氨基,會(huì )導致rhlL.- 2分子的空間結構改NC-mPEG分子表面賴(lài)氨酸的自由氨基，不破壞它的變,而影響其生物學(xué)活性。CC-mPEG可能是活化能力空間結構，所以，修飾物保留了hL- 2分子原有的生很強的PEG活化酯，可以將thlL-2分子內部的賴(lài)氨物學(xué)活性和穩定性。酸自由氨基活化，導致rhlL- 2分子的空間結構的變有關(guān)修飾產(chǎn)物分離純化和其他理化性質(zhì)還在深人化,生物學(xué)活性和蛋白的穩定性都隨之下降。還有一種研究中,將另文發(fā)表?？赡苁歉吣柋鹊腃C-mPEG既是rhlL-2分子的活參考文獻化劑又是變性劑，當加人高濃度的CC- mPEG后,引起rhlL- 2蛋白部分變性，變成部分松散的線(xiàn)形結構，然[1]Rosenberg SA, Lotze MIT, MUUL LM,et al.A progress report on the后CC-mPEG對賴(lài)氨酸自由氨基活化修飾，由于treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine -hlL.- 2分子天然結構的改變,穩定性下降,所以很快activated kllr cells and interleukin - 2 or high - dose inter-leukin - 2 alone. N Engl J Med.1987 Apr 9;316( 15) : 889-97.喪失活性。PEG4000 的加入可以使CC - mPEG的投料摩爾比降低，修飾率提高,但并不對rhlL-2分子的生[2] Molineux G. Pegylation: engineering improved pharmaceuticals forenhanced therapy[J] .Cancer Treat Rev . 2002, 28(Suppl A):13-物學(xué)活性構成保護。這可能是因為CC - mPEG在水相中易水解，而PEG4000可能是CC - mPEG的水解產(chǎn)物[3]中國生物制品標準化委員會(huì )編.中國生物制品規程[M]或產(chǎn)物類(lèi)似物,抑制了水解反應,所以摩爾比下降。因.2000版,化學(xué)工業(yè)出版社.此,經(jīng)研究推斷, CC - mPEG不適合于修飾hlL-2,如[4]Tsuji T, Nakagawa R, sugimoto N, Fukuhara K. Characerzaion of果有其它分子可用CC - mPEG來(lái)修飾時(shí)，可嘗試加入disulfide bonds in recombinant proteins: reuced human interleukinPEG4000，看能否降低投料摩爾比。研究同時(shí)表明,2 in inclusion bodies and its oxidative refolding . Biochemistry.1987 Jun 2:;26(11):3129- 34.NC - mPEG對thIL- 2分子的修飾反應溫和，在適當的Chemical Modification of rhIL- 2 with Activated PolyethyleneZou Xianfeng'Zhang huan', Yang congfei? Yu Zhongmin(1.College of Life Science , Jilin University ,Changchun 130012, China)(2.Changchun Lfe Gene Pharmaceutial Limited Company ,Changchun 130061 ,China)Abstract: Purpose To study the condition of modifying rhlL.- 2 with CC - mPEG and NC - mPEG. Methods RhIL- 2 wasmodifed by activated PEG under various conditions and the bioactivity of the modified rhIL- 2 was analyzed by CTLL- 2cell. Result Along with the increase of the activated polyethylene ,modified rhlL- 2 was increased. The bioactivity of rhlL- 2modified by CC - mPEG was reduced too much, though the incorporation of PEG400 could reduce the use of CC - mPEG, Butthe bioactivity of rhIL - 2 modified by NC - mPEG was saved.key words: RhIL- 2; Activated polyethylene glycol; Chemical modification中國煤化工MYHCNMHG