合成氣和培養基組分對C.autoethanogenum發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響研究

第32卷第9期太陽(yáng)能學(xué)報Vol 32. No 92011年9月ACTA ENERGIAE SOLARIS SINICASep.,2011文章編號:025440%6(2011)09-1370405合成氣和培養基組分對C. autoethanogenum發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響研究郭穎12,許敬亮!,徐惠娟',袁振宏,梁翠誼(1.中國科學(xué)院廣州能源研究所,中國科學(xué)院可再生能源與天然氣水合物承點(diǎn)實(shí)驗室,廣州510640;國科學(xué)院研究生院,北京100049)摘要:以合成氣發(fā)酵菌株 Clostridium autoethanogenum DSMI0061為研究對象研究改良DSM培養基640,添加玉米漿焦油含量和產(chǎn)物濃度對合成氣發(fā)酵的影響。結果表明:玉米漿濃度為0.175gL時(shí)利于合成氣乙醇發(fā)酵。適量的焦油有利于乙醇的生成抑制乙酸的產(chǎn)生。低濃度的乙醇和乙酸能促進(jìn)對應產(chǎn)物乙酸和乙醇的生成,但隨著(zhù)濃度的升高,乙醇和乙酸均會(huì )嚴重抑制產(chǎn)物的生成。關(guān)鍵詞:合成氣發(fā)酵; Clostridium autoethanogenwm;乙醇中圖分類(lèi)號:TK5114文獻標識碼:A0引言1材料和方法合成氣乙醇發(fā)酵即將木質(zhì)纖維素原料全組分1.1菌株(包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素)全部氣化,轉化發(fā)酵菌株C. autoethanogenum DSM10061購于為以H2、CO和CO2為主要組分的合成氣,然后再德國菌種保藏中心 Deutsche Sammlung von Mikroor利用特殊的微生物將合成氣發(fā)酵為乙醇。該工藝可 ganismen und Zellkulturen gmbH(DSMZ, Braun-有效避開(kāi)木質(zhì)纖維素酸、酶水解的技術(shù)障礙,實(shí)現木 schweig, Germany)。質(zhì)纖維素類(lèi)生物質(zhì)組分的全利用,此外,氣化過(guò)程產(chǎn)1.2培養基及配置方法生的熱還可用來(lái)供暖,做到生物質(zhì)資源的高效利用。DSM640培養基(/L):氯化鎂0.40g,氯化銨目前,在合成氣制備方面,國內外的研究均已較0.90g氯化鈉0.90g,氯化鐵2.5mg,磷酸二氫鉀為成熟,通?？赏ㄟ^(guò)控制熱解工藝條件或氣化方式1.50g,磷酸氫二鉀0.75g,酵母膏1.00g,木糖5.00g,制備出高質(zhì)量的合成氣。目前,國外合成氣發(fā)酵研纖維二糖1.0g,半胱氨酸0.75g,刃天青0.50mg究主要集中在發(fā)現較早的 Clostridium jundah和10mL微量元素溶液,pH=6.0。Clostridium carboxidivorans兩株專(zhuān)利菌上214),而針改良培養基(/L):硫酸鎂0.20g,氯化銨1.00g,對非專(zhuān)利菌 Clostridium autoethanogenum的研究則較氯化鈉0.80g氯化鈣0.02g磷酸二氫鉀0.1g,氯化少131。本研究擬通過(guò)改良發(fā)酵培養基的配方,考鉀0.1g,酵母膏1.00g,木糖5.00g,半胱氨酸C. autoethanogenum發(fā)酵的影響試圖開(kāi)發(fā)出合成氣維生素貯液,pH=6.0(7'l0mL微量元素溶液10mL察不同玉米漿濃度、焦油組分和產(chǎn)物濃度對0.75g,刃天青0.50mg發(fā)酵的高效轉化工藝技術(shù),為加快這一工藝的實(shí)用發(fā)酵培養基(凵):硫酸鎂0.20g,氯化銨1.00化進(jìn)程做有益探索。氯化鈉0.80g,氯化鈣0.02g,磷酸二氫鉀0.10g,氯中國煤化工收稿日期:20090927基金項目:中國科學(xué)院知識創(chuàng )新工程重要方向項目(KGCX2YW335;KSCX2dHCNMHG發(fā)展(863)計劃(2007AAO57406)通訊作者:許敬亮(1977-),男,副研究員,主要從事生物質(zhì)能源的開(kāi)發(fā)。習@ms,ge,wc,cn9期郭穎等:合成氣和培養基組分對C. autoethanogenum發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響研究1371化鉀0.1g,酵母膏0.15g,半胱氨酸0.75g,刃天青后,再以40℃/min升至250℃。0.50mg,10mL微量元素溶液,10mL維生素貯液,pH=4.5,CO/CO2(95/5)(21。2結果與討論維生素貯液(L):吡哆醇0.010g,維生素B10005g,核黃素0.0058,泛酸鈣0.008g,硫辛酸2.1培養基改良0005g,對氨基苯甲酸0.005g,煙酸0.005g,維生素按5%的接種量,將發(fā)酵菌株分別接入培養基B20.005g,生物素0.002g,葉酸0.002g,2-巰基乙烷DSM640和含5g/L木糖的改良培養基中,37℃,培養磺酸鈉( MESNA)0.010g。104h,測其OD值,結果如圖1。微量元素貯液(/L):氨三乙酸2.00g,硫酸錳00g,硫酸亞鐵銨0.80g,氯化鈷0.20g,硫酸鋅0.20g,氯化銅0.02g,氯化鎳0.02g,鉬酸鈉0.02g硒酸鈉0.02g,鎢酸鈉0.02g。所有培養基在滅菌前先放入厭氧箱(N285%,H210%,CO25%)中24~36h,緩慢除去其中的溶解氧,并加入0.5mg/L的刃天青做為指示劑,然后100120121℃高壓蒸汽滅菌20min。維生素溶液和還原性劑時(shí)間h半胱氨酸采用0.45μm的濾膜過(guò)濾除菌。圖1菌株C. autoethanogenum在培養基DSM640上的13合成氣組分的影響生長(cháng)曲線(xiàn)接種發(fā)酵菌株到只含氣態(tài)碳源CO或CO2的發(fā)Fig. 1 Growth curve of C. autoethanogenum cultured with酵培養基中,37℃,培養72h后離心取發(fā)酵液上清,edium DSM640分析產(chǎn)物組成。前期研究發(fā)現,細胞干重和OD值的對應關(guān)系14玉米漿濃度的影響為每ODa值對應C. autoethanogenum的細胞干重為剔除發(fā)酵培養基中的酵母膏和維生素,在以CO304mg/L。由圖1可知,菌株C. autoethanogenum在為氣態(tài)碳源的發(fā)酵培養基中添加不同濃度的玉米改良培養基的生長(cháng)曲線(xiàn)近似與其在培養基DSM40漿(00.0750.150、0.2810.375g/L),37℃,分別培的生長(cháng)曲線(xiàn),可見(jiàn)C. autoethanogenum菌株也能在養72h,發(fā)酵液離心取上清分析產(chǎn)物組成。改良培養基中生長(cháng)良好(見(jiàn)圖2)1.5焦油及其主要組分的影響參考合成氣中焦油的實(shí)際組成和含量,添加不同濃度的焦油組分,研究它們對C. autoethanogenum發(fā)酵產(chǎn)物組成的影響。16產(chǎn)物濃度的影響將不同濃度的乙醇、乙酸分別加人到合成氣發(fā)酵培養基,以研究產(chǎn)物濃度對C. autoethanogenum發(fā)酵產(chǎn)物組成的影響。時(shí)間/h17產(chǎn)物分析將發(fā)酵液于-4℃,14000min離心10min,取圖2菌株 C autoethanogenum在改良培養基上的生長(cháng)曲線(xiàn)上清分析。乙醇和乙酸濃度含量測定采用 AgilentFig 2 Growth curve of C. autoethanogenumcultured with the developed medium6820氣相色譜,檢測器采用FID,柱子為30mx0.25mm×0.25μ m DB-FFAP載氣為氮氣,載氣流率2合成氣組分的影響將C.中國煤化工30mL/min,分流比1:50。色譜進(jìn)樣口和檢測器的溫接入以CO或度分別為250℃和30℃。色譜柱溫初始溫度為CO2為氣態(tài)以…人CNMH,培養72h。取發(fā)40℃,維持5min,然后以20℃/min速度升至140℃酵液離心取上清分析產(chǎn)物組成,結果如圖3和圖4。1372太陽(yáng)能學(xué)報32卷由表1知,當玉米漿濃度為0075g/L時(shí)乙醇產(chǎn)O2乙酸2乙醇量高于含酵母膏的培養基中的乙醇產(chǎn)量,顯著(zhù)高于T含酵母膏的乙酸產(chǎn)量。此后,隨著(zhù)玉米漿濃度的升高乙醇產(chǎn)量逐步降低,而乙酸產(chǎn)量在0.281g/L后又禮1略有升高。濃度為0.075g/L的玉米漿最適合乙醇的生成。因此,該濃度的玉米漿可用于替代傳統培養基中的維生素和酵母膏。2.4焦油主要成分的影響時(shí)間/h生物質(zhì)氣化后會(huì )含有焦油等雜質(zhì)。焦油成分復圖3C. autoethanogenun菌株利用CO2發(fā)酵產(chǎn)雜,不同氣化條件下焦油成分差異很大,但均含有一乙醇和乙酸定量的甲苯和苯酚,因此將焦油(模擬實(shí)際焦油中的Fig 3 Production of ethanol and acetic acid by含量)加入培養基,37℃,培養72h。提取發(fā)酵液,研C. autoethanogenum with CO, as carbon source究其對發(fā)酵產(chǎn)物組成的影響,結果如表2表2C. autoethanogenum菌株對焦油主要成分的耐受性Table 2 tolof C. autoetteCo乙醇main components of tarsCO乙酸添加物含量/mg·L1乙醇/mg·L乙酸甲苯0.886216苯酚焦油時(shí)間/hCK圖4C. autoethanogenum菌株利用CO發(fā)酵產(chǎn)乙醇乙酸由表2可知,甲苯能使乙醇的產(chǎn)量略微升高,但ig. 4 Production of ethanol and acetic acid by乙酸產(chǎn)量卻有一定程度的下降。苯酚能使乙醇的產(chǎn)cO as carbon source量顯著(zhù)升高,乙酸產(chǎn)量有一定程度的下降。添加焦由圖3和圖4知,發(fā)酵菌株利用CO產(chǎn)乙醇和乙油也能使乙醇的產(chǎn)量升高,但乙酸的產(chǎn)量也有一定酸的產(chǎn)量均高于利用CO2發(fā)酵的產(chǎn)量。合成氣組分程度的下降。由此可知,焦油的主要成分能促進(jìn)乙中CO是能被C. autoethanogenum菌株較好利用的氣醇的生成并有抑制乙酸產(chǎn)生的作用。態(tài)碳源。故選擇CO作為進(jìn)一步研究的氣態(tài)碳源。Ahmed A等研究發(fā)現合成氣中微量的焦油能2.3玉米漿濃度的影響促進(jìn)C. carboxidivorans發(fā)酵產(chǎn)物中乙醇生成并抑制乙酵母膏和維生素是合成氣發(fā)酵培養基的主要組酸產(chǎn)生。由表2知焦油對株 C. autoethanogenum的分,使用成本相對較高。本實(shí)驗試圖用相對廉價(jià)的影響類(lèi)似于焦油對 C. carboxidivorans菌株的影響但玉米漿替代發(fā)酵培養基中的酵母膏和維生素,以降這規律(即焦油抑制乙酸產(chǎn)生促進(jìn)乙醇產(chǎn)生的機低培養基的成本,結果如表1理)是否普遍適于合成氣發(fā)酵菌株還有待進(jìn)一步研表1玉米漿濃度對 c autoethanogenum發(fā)酵產(chǎn)物組成影響究。Table 1 Effects of com steep liquor concentration on the2.5產(chǎn)物濃度對合成氣發(fā)酵的影響production of C. autoethanogenum為了驗證發(fā)酵菌株是否存在產(chǎn)物反饋抑制現玉米漿/g·L酵母膏/g·L乙醇/m·L乙酸/mg,L象將發(fā)酵菌株C. autoethanogenum的發(fā)酵產(chǎn)物乙0.15475酸(同時(shí)也是焦油的主要成分)和乙醇分別添加到不同濃度的乙0.0750000061772h,提取發(fā)酵中國煤化工,37℃,培養情況,結果如0.281表3。由表3司A是限及以好把業(yè)著(zhù)促進(jìn)乙酸0.375的生成但高濃度的乙醇反而抑制乙酸的產(chǎn)生。同9期郭穎等:合成氣和培養基組分對C. autoethanogenun發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響研究1373樣,一定濃度的乙酸能促進(jìn)乙醇的生成,但隨著(zhù)乙酸obic ethanol and acetate producing microorganism[P]濃度的上升,也能抑制乙醇的產(chǎn)生。因此在連續培U.S.:5173429,1992養C. autoethanogenum時(shí),乙醇和乙酸積累到一定[3] Tanner R S,MrLM, Yang D. Clostridium yjungdal程度時(shí),應盡快移除,以減弱高濃度產(chǎn)物對菌株發(fā)酵sp-nov, an acetogenic species in clostridial ribosomal-rma的影響。homology group-I[J]. International Joumal of SystematicBacteriology,1993,43(2):232-236.表3C. autoethanogenum菌株對其產(chǎn)物的耐受性[4 Najafpour G, Younesi H. Ethanol and acetate synthesisTable 3 Tolerance of C. autoethanogenum to the productsh culture of Clostridium添加物含量/g·L1乙醇/m·L-1乙酸/ng·Ldahli[ J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 38乙醇50.0(1-2):223-228乙醇5.03816[5] Younesi H, Najafpour G, Mohamed A R. Ethanol and ac-乙醇0.54515乙酸50.0processes using anaerobic bacterium, Clostridium ljung-乙酸5.062dahlin[ J]. Biochemical Engineering Journal, 2005, 27乙酸0.5(2):110-119475[6] Ahmed A, Lewis R S, Fermentation of biomass-generated需要指出的是,C. auloethanogenum菌株用以合synthesis gas: Effects of nitric oxide[ J]. Biotechnology成氣發(fā)酵,最終的乙醇產(chǎn)量很低(最高僅89mg/L)。and Bioengineering, 2007, 97(5): 1080--1086雖然這一結果略高于文獻[13]用培養基DSM640在[7] Rajagopalan S, Datar R P, Lewis R s. Formation of etha-連續供氣的反應器中獲得的60mg/L乙醇濃度,但nol from carbon monoxide via a new microbial catalyst該產(chǎn)量比通過(guò)其他方法得到的乙醇產(chǎn)量低很多。因J]. Biomass& Bioenergy, 2002, 23(6): 487-493此需要進(jìn)一步提高合成氣發(fā)酵產(chǎn)乙醇的能力。一方8] Datar R P, Shenkman R M, CateniB G,etl. Fermenta-面可以通過(guò)反應器的設計增加氣液傳質(zhì)的速率,使tion of biomass-generated producer gas to ethanol[ J]. Bi菌株能更好地利用合成氣,從而提高乙醇的產(chǎn)otechnology and Bioengineering, 2004, 86(5): 587-量1)。另一方面也可以通過(guò)發(fā)酵培養基和發(fā)[9] Lewis R S, Randy S H, Raymond,el. Biomass to酵工藝優(yōu)化,來(lái)提高乙醇的產(chǎn)量H。ethanol: A holistic approach using gasification-fermenta3結論tion[J]. Abstracts of Papers American Chemical So2004,227(1):2961)C. autoethanogenum菌株能在成分相對簡(jiǎn)單[10] Lewis R s, Tanner R s, Huhnke R L. New biologically的改良培養基中生長(cháng)良好?？梢杂?.075g/L的玉pure culture of Clostridium carboxidivorans, useful for in米漿替代發(fā)酵培養基中的酵母膏和維生素;direct and direct fermentation of biomass to fuel alcohol2)合成氣組分中的CO較CO2更適合充當[P].U.S.:2007275447-A1,2008C. autoethanogenum E株發(fā)酵的氣態(tài)碳源。焦油的[11] Lewis R S, Frankman R S, Allyson T, et al. Ethanol via主要成分能促進(jìn)乙醇的生成抑制乙酸的產(chǎn)生;biomass-generated syngas[J]. Intemational Sugar Jourl,2008,l10(1311):1503)低濃度的乙醇和乙酸能促進(jìn)對應產(chǎn)物乙酸和乙醇的生成但隨著(zhù)濃度的升高,乙醇和乙酸均會(huì )嚴[12] Ahmed A, Catena B G, Hunker l,etal. Effects of bieneratedr gas constituents on cell growth重抑制產(chǎn)物的生成。product distribution and hydrogenase activity of Clostridia[參考文獻]um carboxidiDorans P 7[J].Biomass2006,30(7):665-672[1] Huber G W, Iborra S, Corma A. Synthesis of transporta- [13]Cotter J L, Chinn M S, Grunden A M. Influence oftion fuels from biomass: Chemistry, catalysts, and engi-中國煤化工 ridium如 indahneering[J]. Chemical Reviews, 2006, 106(9):4044and closCNMH ENthesis gas[J]Enzyme andrechnology,2009,44(5):2812 Gaddy J L, Clausen E C. Clostridium ljungdahlii, an aer-1374太陽(yáng)能學(xué)報32卷[14] Cotter J L, Chinn M S, Grunden A M. Ethanol and ace-autoethanogenum using resting cells[J]. Bioprocess andtate production by Clostridium yiungdahlii and ClostridiumBiosystems Engineering, 2009, 32(3): 369-380STUDY ON COMPOSITION EFFECTS OF SYNGAS AND MEDIUMON ETHANOL PRODUCTION WITH Clostridium autoethanogenumGuo Ying, Xu Jingliang, Xu Huijuan, Yuan Zhenhong, Liang Cuiyi'(1. Key Laboratory of Renewable Energy and Gas Hydrate, Guangzhou Institute of Energy Conversion, Chinese Academy of SciencesGuangzhou 510640, China: 2. Graduate Universiy of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049,ChinaAbstract The medium DSM640 was further developed for the syngas fermentation of acetogen Clostridium autoeth-anogenu. The effects of different concentrations of com steep liquor, main components of tars and composition ofproducts on the ethanol production of C. autoethanogenum were studied. The results showed that 0. 175g/L of cornsteep liquor is suitable for syngas fermentation and appropriate contents of tars contributed to the production of ethanol and hampered the production of acetate. Lower concentration of ethanol and acetate are good for the productionof ethanol and acetate, and the production ethanol and acetate would be seriously inhibited conversely with the in-creasing of the product concentrationKeywords: syngas fermentation; Clostridium autoethanogenum; ethanol中國煤化工CNMHG