乙醇濃度對人參多糖分離的影響

第41卷第2期東北師大學(xué)報(自然科學(xué)版Vol. 41 No, 22009年6月Journal of Northeast Normal University(Natural Science Edition)June 2009[文章編號]1001832(2009)02-0154-06醇濃度對人參多糖分離的影響朱梅',畢宏濤2,楊威2,劉楊2,臺桂花2,周義發(fā)2(1.北華大學(xué)化學(xué)與生物學(xué)院,吉林吉林132013;2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長(cháng)春130024)[摘要]研究了不同濃度的乙醇對人參多糖分離的影響.結果表明,乙醇濃度在很大程度上影響著(zhù)人參多糖的分離效果和產(chǎn)率,通過(guò)對不同濃度乙醇提取和沉淀的多糖組成和相對分子質(zhì)量的分析,得出了分離人參多糖的簡(jiǎn)便方法:依次用體積分數為70%,50%,30%的乙醇和蒸餾水提取,經(jīng)大孔樹(shù)脂和透析分離,可分別得到皂武、單寡糖、中性多糖和酸性多糖;人參水提取液經(jīng)40%60%,70%的乙醇分步醇沉,可分別得到不同相對分子質(zhì)量的多糖和單寡糖[關(guān)鍵詞]人參多糖;索氏提取法;乙醇分級;人參寡糖[中圖分類(lèi)號]Q538[學(xué)科代碼]180·1720[文獻標識碼]A人參( Panar ginseng C.A. Meyer)是五加科( Araliaceae)人參屬植物,其根為名貴中藥,在我國和亞洲有著(zhù)數千年的藥用歷史.人參具有多種藥理功能,其活性成分為人參皂苷、多糖、多肽和少量的小分子物質(zhì).人參多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等藥理活性10),近些年來(lái)隨著(zhù)糖生物學(xué)研究的迅速發(fā)展,人參多糖也越來(lái)越多地引起了人們的關(guān)注.大量的研究表明,人參多糖的相對分子質(zhì)量和組成與活性有著(zhù)密切的關(guān)系11.通常水提取的人參多糖往往含有人參單寡糖和人參皂甙,需要經(jīng)過(guò)復雜的分離純化過(guò)程才能得到人參多糖純品影響人參多糖的研究和應用本文探討了利用不同濃度的乙醇提取人參多糖和沉淀人參多糖的過(guò)程,并對所得人參多糖的產(chǎn)率和組成進(jìn)行了研究,以期優(yōu)化一種簡(jiǎn)便易行的分離人參多糖的方法1實(shí)驗部分1.1材料、試劑與儀器實(shí)驗所用干燥人參根購于吉林省撫松縣人參種植基地,經(jīng)粉碎后用于人參多糖的提取.單糖、二糖及三糖標準品均為 Sigma- Aldrich公司產(chǎn)品, Sephadex G75凝膠為 Pharmacia公司產(chǎn)品,D101型非極性大孔樹(shù)脂(凈品級)為天津海光試劑有限公司產(chǎn)品,其余均為國產(chǎn)分析純試劑實(shí)驗儀器: Shimadzu10ATvp高效液相色譜儀(日本島津);723型分光光度計(上海精科);FD1A冷凍干燥機(北京博醫康);z36HK高速冷凍離心機(德國 Herrle)1.2實(shí)驗方法1.2.1不同濃度乙醇提取分級人參多糖1.2.1.1人參多糖的提取將50g人參干粉裝入索式提取器中,加入300mL99.7%(體積分數)的乙醇80℃條件下進(jìn)行索式提取,每隔1h用薄層層析法(TLC)檢測虹吸回流的液滴待硅膠板上各點(diǎn)的顏色基本消失時(shí),停止加熱;冷卻至室溫后,離心將提取液和殘渣分離提取液旋轉蒸發(fā)除去乙醇后冷凍干燥,殘渣按照上述操作依次用90%80%,70%,60%,50%,30%的乙醇溶液和蒸餾水進(jìn)行提取[收稿日期]2009-01-23[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項H(30770489);吉林省科技發(fā)展計劃項目(200707[作者簡(jiǎn)介]朱梅(1963-),女,副教授,主要從事藥用植物資源研究;周義發(fā)(1962-),男博士教授,博士研究生導師,主要從事多糖的結構與功能研究第2期朱梅,等:乙醇濃度對人參多糖分離的影響1551.2.1.2人參多糖的分離采用D101型非極性大孔樹(shù)脂對提取液中的皂甙和糖類(lèi)化合物進(jìn)行分離,樣品依次用蒸餾水和梯度乙醇溶液洗脫,TLC跟蹤檢測1.2.1.3TLC檢測人參多糖、單寡糖及皂甙采用硅膠G薄層層析板(厚約025mm);展層劑為氯仿與甲醇的混合溶液(V(氯仿):v(甲醇)v(水)=65:35:10);顯色劑為5%硫酸乙醇溶液在此檢測條件下,人參多糖由于極性大而位于原點(diǎn)處且為黃色斑點(diǎn);人參皂甙和人參單寡糖由于極性相對較小而隨展層劑展開(kāi),人參皂甙為粉紅色斑點(diǎn),人參單寡糖為黃棕色斑點(diǎn)斑點(diǎn)顏色的深淺與物質(zhì)的含量直接相關(guān),顏色越深含量就越高,因此可以用TLC估算出產(chǎn)物中人參多糖、人參皂甙和人參單寡糖的相對含量.1.2.2不同濃度乙醇沉淀分級人參多糖將500g人參干粉用蒸餾水進(jìn)行索氏提取,提取液濃縮至2L后,等分成4份備用1.2.2.1分別醇沉取3份濃縮液,緩慢加入96%的乙醇,使乙醇的體積分數分別達到70%,75%和80%;靜置過(guò)夜離心,得到的上清和沉淀分別記作:GRS1和GR-P-1;GRS2和GR-P2;GR-S3和GRP3,沉淀常規干燥,上清旋轉蒸發(fā)除去乙醇后冷凍干燥1.2.2.2分步醇沉取1份濃縮液,緩慢加入96%的乙醇使乙醇的體積分數達到40%靜置過(guò)夜,離心沉淀(GRPa)常規干燥;向上清繼續加入96%乙醇,使乙醇的體積分數達到60%靜置過(guò)夜,離心,沉淀(GRPb)常規干燥;再向上清中加入96%乙醇,使乙醇的體積分數達到70%,靜置過(guò)夜,離心,沉淀(GRPc)常規干燥,上清(GRS’)旋轉蒸發(fā)除去乙醇后冷凍干燥1.2.3相對分子質(zhì)量分布檢測采用 Sephadex G75(2cm×100cm)凝膠色譜柱檢測所得產(chǎn)物相對分子質(zhì)量的分布,洗脫液為0.15mol/ L Nacl,洗脫速率0.15mL/min,苯酚-硫酸法連續檢測1.2.4單糖組成分析1.2.4.1樣品的甲醇解及酸水解稱(chēng)取2mg樣品,加入1mL2mol/L的無(wú)水鹽酸甲醇,充氮氣封管,80℃水解16h;氮氣吹干后,再加入1mL2mol/L三氟乙酸,120℃水解1h,水解產(chǎn)物轉入蒸發(fā)皿中,加入適量無(wú)水乙醇除去三氟乙酸,水浴蒸干1.2.4.2單糖衍生物的制備衍生化過(guò)程參照文獻[16]的方法稍作改進(jìn):向樣品水解產(chǎn)物中加入0.5mL1-苯基3-甲基5-吡唑啉酮(PMP)試劑和0.5mL0.3mol/ L NaOH溶液,70℃反應30min,鹽酸中和,氯仿萃取過(guò)量的PMP試劑后,對所得的單糖PMP衍生物進(jìn)行HPLC分析1.2.4.3高效液相色譜分析采用 Shimadzu10ATvp高效液相色譜系統進(jìn)行色譜分析,檢測波長(cháng)245nm,色譜柱 DIKMA Inertsil ODS3(5pm,150mm×4.6mm),柱溫35℃,流速1.0m/min,流動(dòng)相:187%乙腈+81.3%磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L,pH=7.0)2結果與分析2.1不同濃度乙醇提取人參多糖2.1.1第一次索氏提取為了進(jìn)行提取條件的初步篩選,分析人參中皂甙、單寡糖和多糖用不同濃度的乙醇提取時(shí)的分布情況第一次索氏提取采用了99.7%90%80%,70%,60%,50%,30%的乙醇溶液和蒸餾水8個(gè)濃度梯度.提取結果見(jiàn)表1,其中提取時(shí)間為T(mén)LC檢測不到提取物的時(shí)間由表1可見(jiàn),80%的乙醇所需的提156東北師大學(xué)報(自然科學(xué)版)第41卷取時(shí)間最短80%以下濃度的乙醇所需提取時(shí)間明顯增長(cháng),說(shuō)明人參中皂甙比多糖更易于提取由于最初的乙醇濃度較高提取物多數是易溶于醇的皂甙,隨著(zhù)水的增多,寡糖逐漸被提取出來(lái),水到達70%時(shí),只有多糖被提取來(lái)這樣,大部分人參皂甙被90%的乙醇提取出來(lái),其余皂甙存在于乙醇體積分數≥70%的提取物中,單寡糖存在于90%~50%的乙醇提取物中,多糖存在于乙醇體積分數≤60%的提取物中,其中30%乙醇和蒸餾水的提取物中只有多糖,多糖提取量最大表1第一次索式提取的結果實(shí)驗項乙醉提取液體積分數/%提取時(shí)間/h提取物組成皂甙單寡糖單寡糖多糖(含量從多到少排列)皂試單寡糖單寡糖單寡糖多糖提取物質(zhì)量/g1.181.520.930.69產(chǎn)率/%3.04由此可知,70%的乙醇可以將絕大部分人參皂表2第二次索式提取的結果甙提取出來(lái),50%的乙醇可以將剩余的人參單寡糖乙醇提取液體積分數/%實(shí)驗項目HgO提取出來(lái),30%的乙醇和蒸餾水提取的基本是不摻提取時(shí)間/h雜皂甙和單寡糖的人參多糖.提取溫度/℃0302.1.2第二次索氏提取提取物質(zhì)量/84.93(皂甙)0.18(多糖)1.103.78根據第一次索氏提取的結果,第二次索氏提取9.05(寡糖)0.75(單寡糖)(多糖)(多糖)只采用了4個(gè)濃度梯度,即70%,50%,30%的乙醇產(chǎn)率/%.86(膩)0.36(多糖)2.207.56和蒸餾水.70%乙醇提取后,用大孔樹(shù)脂分離提取物18.10(寡糖)1.50(單寡糖》(多糖)(多糖)中的皂甙和單寡糖;50%乙醇提取后,透析分離提取液中的單寡糖和多糖.分析結果見(jiàn)表2.r/ mina單糖標準品:b.經(jīng)70%乙醇提取,大孔樹(shù)脂分離所得的人參單寡糖;c.50%乙醇提取的人參多糖;d30%乙醇提取的人參多糖e.蒸餾水提取的人參多糖.1PMP;2.甘露糖;3.鼠李糖;4.葡萄糖醛酸;5,半乳糖醛酸;6.葡萄糖;7.半乳糖;8.木糖;9.阿拉伯糖圖1第二次索氏提取各產(chǎn)物單糖組成色譜圖單糖組成分析結果(見(jiàn)圖1)顯示:70%乙醇提取經(jīng)大孔樹(shù)脂分離所得的單寡糖主要含有97%的葡萄糖;50%乙醇提取,經(jīng)透析分離所得的多糖由葡萄糖(83%)、阿拉伯糖(11%)和半乳糖(3%)組成,含有痕量的甘露糖和鼠李糖;30%乙醇提取的多糖由葡萄糖(55%)、阿拉伯糖(14%)、半乳糖(23%)和半乳糖醛酸(8%)組成;蒸餾水提取的多糖由半乳糖醛酸(43%)、葡萄糖(34%)和半乳糖(9%)組成,含有少量的阿拉伯糖、甘露糖和鼠李糖第2期朱梅,等:乙醇濃度對人參多糖分離的彩響157由圖1可見(jiàn),人參多糖的單糖組成與乙醇提取液的體積分數有很大的關(guān)系隨著(zhù)乙醇體積分數的降低,葡萄糖的含量逐漸減小,半乳糖醛酸含量逐漸增大,尤其是蒸餾水提取的多糖中半乳糖醛酸含量超過(guò)了葡萄糖.由此可知,70%乙醇提取經(jīng)大孔樹(shù)脂分離得到由葡萄糖組成的人參單寡糖和人參皂甙,50%乙醇提取經(jīng)透析分離得到人參中性多糖,30%乙醇提取得到含少量半乳糖醛酸的人參酸性多糖蒸餾水提取得到含大量半乳糖醛酸的人參酸性多糖.3.2不同乙醇濃度沉淀分級人參多糖3.2.1分別醇沉將人參根粉碎后用蒸餾水提取,等量的提取液表3平行醇沉的實(shí)驗結果分別用70%,75%和80%的乙醇沉淀分級,結果見(jiàn)物醇沉體積分數/%表3由表3可見(jiàn)沉淀的量隨乙醇體積分數的增大一上請4.9(GRS140.3(RS2)3GRS3)而增大,而醇沉上清的量則是隨乙醇體積分數的增沉淀/g22G0RP1)23.8(GRP2)25(GRP3)大而減小64,1Vt06090120150I80210306090120150180210201.0GR-S-3GR-P-33.00.50.0圖2 Sephadex G75分析平行醇沉產(chǎn)物色譜圖158東北師大學(xué)報(自然科學(xué)版)第41卷用分離范圍在相對分子質(zhì)量為1000~50000的 Sephadex G75凝膠柱層析分析醇沉分級產(chǎn)物,通過(guò)苯酚硫酸法檢測,以洗脫體積為橫坐標,490nm處的吸光值為縱坐標作圖,結果見(jiàn)圖2如圖2所示,醇沉上清均由相對分子質(zhì)量≤1000的單寡糖組成,醇沉沉淀均由多糖和單寡糖組成且沉淀中單寡糖的比例隨著(zhù)乙醇體積分數的增加而增大結果表明,70%乙醇可以將水提物中的多糖完全沉淀下來(lái),但在所選的濃度范圍內一次醇沉不能將單寡糖和多糖徹底分開(kāi).3.2.2分步醇沉將人參干粉用蒸餾水提取,提取液依次用40%,60%和70%的乙醇沉淀分級,所得的沉淀和上清利用 Sephadex g-75進(jìn)行分析,通過(guò)苯酚-硫酸法檢測,以洗脫體積為橫坐標,490nm處的吸光值為縱坐標作圖,結果見(jiàn)圖3。110~3060901V/mLGR-P.bGR-SL020150180210V/mL圖3 Sephadex-75分析分步醇沉產(chǎn)物色譜圖如圖3所示,當溶液醇體積分數為40%時(shí),沉淀中只含有多糖,且多糖的相對分子質(zhì)量≥50000;醇濃度增加至60%時(shí),在總體積與外水體積之間有明顯的寬峰呈現,說(shuō)明相對分子質(zhì)量<50000的多糖也被沉淀下來(lái),其與相對分子質(zhì)量為50000以上的多糖含量比約為2:1,總體積處仍沒(méi)有洗脫峰出現雜,有大量的多糖和單寡糖同時(shí)存在,含量比約為1(相對分子質(zhì)量≥5則/說(shuō)明無(wú)單寡糖被沉淀下來(lái);當溶液的醇濃度達到70%時(shí),沉淀中糖類(lèi)物質(zhì)的相對分子質(zhì)量分布最為4(1000<相對分子質(zhì)量<50000):3(單寡糖),上清中只存在人參寡糖3結論本文采用不同體積分數的乙醇對人參多糖進(jìn)行了提取和沉淀分離.結果表明,乙醇體積分數很大程度上影響著(zhù)提取和沉淀分級產(chǎn)物的組成、相對分子質(zhì)量和產(chǎn)率,為提取不同的人參多糖提供了可以參考的方法根據乙醇濃度對人參皂甙、人參單寡糖和不同單糖組成的人參多糖的溶解度的影響依次用70%50%30%的乙醇和蒸餾水提取,通過(guò)大孔樹(shù)脂和透析將人參皂甙、人參單寡糖和人參多糖分離同時(shí)將人參多糖分為中性多糖、含少量半乳糖醛酸的酸性多糖和含大量半乳糖醛酸的酸性多糖.第2期朱梅,等:乙醇濃度對人參多糖分離的影響159根據乙醇體積分數對人參寡糖和不同相對分子質(zhì)量的人參多糖溶解度的影響用40%,60%70%的乙醇分步醇沉可以分別得到單寡糖、相對分子質(zhì)量>1000的多糖和相對分子質(zhì)量≥50000的多糖[參考文獻][1]陳萍權宜淑.人參與西洋參研究進(jìn)展「門(mén).基層中藥雜志,200,14(1):59-61.[2]張彬林瑞超馮芳.人參多糖的研究概況「J].中國藥事,2004,18(9):566569[3]劉國臣,李盛鈺,何大俊等,甾體皂苷的選擇性酸水解研究[].東北師大學(xué)報:自然科學(xué)版,2007,39(2):87-91[4]任莉莉魏影非,杜惠蘭,人參抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J中成藥2005,27(8):947950.[5]傅平平,王維盅,高其品.人參根多糖化學(xué)性質(zhì)及抗腫瘤活性的研究[J].白求恩醫科大學(xué)學(xué)報,199420(5):439-441[6] XIAO BO SUN, TSUKASA MATSUMOTO, HIROAKI KIY(HARA et al. Cytoprotective activity of pectic polysaccharidesfrom the root of Panar ginseng[J] Journal of Ethnopharmacology, 1991, 31(1).101-107.7]臺桂花,張翼伸,梁忠巖.人參莖中水溶性多糖的研究[J.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報1988,20(2):119122[8]趙俊.人參多糖的化學(xué)與藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].國外醫學(xué)中醫中藥分冊,2004,26(2):7981.[9]楊明崔志勇,王巖.人參多糖降血糖和肝糖原作用的研究[J中藥藥理與臨床,19917(5):2224[10]楊明,崔志勇,王巖.人參多糖對動(dòng)物正常血糖及各種實(shí)驗性高血糖的影響[]中國中藥雜志,1992,17(8):500-501[11 SUN XIAO-BO, TSUKASA MATSUMOTO. HIROAKI KIY(HARA et al. Cytoprotective activity of pectic polysaccharides[12] MASASHI TOMODA, KEIKO HIRAABAY ASHI NORIKO SHIMIZU, et al. Characterisation of two novel polysaccharideshaving immunological activities from the root of Panar ginseng [J]. Biol Pharm Bull, 1993, 16(11): 1087-1091.[13]傅平平,維盅高其品,等.人參根多糖化學(xué)性質(zhì)及抗腫瘤活性的研究[J白求恩醫科大學(xué)學(xué)報,199420(5):43941.[14] YOSHIKO SOMODA. TADASHI KASAHARA, NAOFUMI MUKAIDA, et al. Stimulation of interleukin-8 production bygiseng [ Immunopharmacology, 1998,38:287-290.[15] JI-HYE LEE KYUNG HYUN KIM. 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The produced polysaccharides were different among their molecu-lar weight, composition by different ethanol concentration. In addition, the yields and isolation timewere different, too. Base on the results, a procedure for the isolation of ginseng polysaccharides was setup. Ginseng roots can be extracted sequentially by 70%, 50%, 30% and 0 of ethanol to give ginsenasides, oligosaccharide (including monosaccharide), neutral polysaccharides, acidic polysaccharides, re-spectively. In contrast, a series of polysaccharides with different molecular weight and oligosaccharides(including monosaccharides) were obtained by stepwise adding ethanol.Keywords: ginseng polysaccharide i Soxhlet extraction ethanol fractionation; ginseng oligosaccharide(責任編輯:方林)