乙醇對土壤轉化酶活性的影響

第34卷第9期西北農林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)2006年9月 Vol. 34 No. 9 Jour. of Northwest Sci-Tech Univ. of Agri. and For. (Nat. Sci. Ed.)Sep.2006乙醇對土壤轉化酶活性的影響王聰穎,和文祥,何敏超(西北農林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,陜西楊凌712100[摘要]研究了不同濃度乙醇對土壤轉化酶活性的影響以及不同底物(蔗糖)濃度對乙醇與轉化酶活性關(guān)系的影響。結果表明,乙醇可明顯抑制土壤轉化酶活性,其濃度與土壤轉化酶活性呈顯著(zhù)或極顯著(zhù)相關(guān),其作用方式為直接抑制乙醇輕度污染時(shí)的生態(tài)劑量ED1值為29.47%~35.27%,表明乙醇是一種毒性不強的有機污染物;底物濃度可放大乙醇與土壤轉化酶活性之間的關(guān)系;乙醇加導致土壤轉化酶的Km和vm值小,揭示其作用機理為完全抑制作用,包括競爭性和非競爭性抑制作用。[關(guān)鍵詞]乙醇;轉化酶活性;動(dòng)力學(xué);作用機理[中圖分類(lèi)號]S154.2[文獻標識碼]A[文章編號]1671-93872006)09-0125-05乙醇作為一種有機污染物,其來(lái)源非常廣泛,可染的程度;甲苯進(jìn)入土壤后會(huì )顯著(zhù)提高土壤脲酶的大量存在于一些生活和工業(yè)廢水中在土壤有機物活性,甲醇可增加大多數土壤脲酶的活性等但至今質(zhì)(秸稈、有機肥料等)的轉化過(guò)程中也會(huì )形成乙醇。有關(guān)乙醇對土壤酶活性的影響鮮見(jiàn)報道為此本試此外,某些農藥原藥在使用時(shí)也需要加人乙醇。這些驗研究了乙醇對土壤轉化酶活性的影響,以期為環(huán)乙醇最終都會(huì )進(jìn)入土壤生態(tài)系統,對土壤性質(zhì)包括境保護提供重要依據。其中生長(cháng)的微生物等產(chǎn)生影響因此,乙醇生態(tài)毒理效應的研究在理論和實(shí)踐上具有十分重要的意義。1材料與方法土壤酶是土壤的重要組成部分,在物質(zhì)轉1.1供試土樣化能量代謝和污染物降解等方面發(fā)揮著(zhù)重要作用。土樣于2002-03采自西北農林科技大學(xué)從近年來(lái),國內外許多學(xué)者3研究了外源污染物(主1979年開(kāi)始的土壤長(cháng)期肥料定位試驗地(培肥方案要包括重金屬、農藥及其他有機物質(zhì))對土壤酶活性見(jiàn)表1)。采樣時(shí)先去除0~5cm的表土,再取5~20的影響,并且取得了較大的進(jìn)展,如發(fā)現采用多個(gè)土cm土層的土樣,混勻風(fēng)干后,過(guò)1mm篩備用。壤酶構建的酶系統可較為敏感地表征土壤重金屬污表1供試土壤的培肥方案 Table, 1 Design of long-term fertilizer experiment kg/hm2'土樣編號 Soil samples處理尿素過(guò)磷酸鈣秸稈 Treatment Urea Ca(H2PO)2肥 Straw Manure無(wú)肥o- o-fertilizer0000化肥 Chemical fertilizer52500高 High straw4505375000450525375001.2乙醇對土壤轉化酶活性的影響基水楊酸比色法0測定土壤轉化酶活性。土壤轉化取5.00g土樣,向其中加入5滴甲苯后,再加1酶活性單位定義為每小時(shí)在1g土樣中由蔗糖轉mL不同體積分數(0%,5%,10%,25%,50%,化成葡萄糖的毫克數。每處理重復3次,并設無(wú)底物100%)的乙醇溶液混勻后靜置30min,最后加15和無(wú)土壤處理為對照。mL濃度為80g/L的蔗糖溶液和5mL磷酸緩沖液1.3底物濃度對乙醇與土壤轉化酶活性關(guān)系的影響(pH5.5),搖勻,37C培養5h后取樣。用3,5-二硝以1號土樣為例,實(shí)驗方法同1.2.1,底物蔗糖[收稿日期]2005-10-08[基金項目國家自然科學(xué)基金項目(4030102)國家973重點(diǎn)基礎研究發(fā)展計劃子項目(2004CB418506)[作者簡(jiǎn)介]王聰穎(1981),女[通訊】王聰(1=:,西長(cháng)人,在讀硬士,主要從事土壤生物化學(xué)和生態(tài)毒理研究e-malwxh968163.co要從事土壤生態(tài)毒理研究者]和文(19男陜西黃龍126西北農林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)第34卷的濃度分別為:0.010,0.025,0.050和0.100應初始和t時(shí)間時(shí)的底物濃度。mol/L,取樣時(shí)間為3hS1.4乙醇作用時(shí)間對土壤轉化酶活性的影響將不同時(shí)間的n和(S-[S])值進(jìn)實(shí)驗方法同1.2.1,乙醇濃度為體積分數50%,行線(xiàn)性擬合,即可求得Km和Vm值靜置時(shí)間分別為:0,15,30,60,120和240min。1.5.2對土壤轉化酶促反應速度常數k的影響1.5乙醇對土壤轉化酶動(dòng)力學(xué)特征的影響以1號土樣為例來(lái)研究乙醇對土壤轉化酶動(dòng)力k=nvv,式中,V和V分別為酶促反應產(chǎn)學(xué)特征的影響。生的最大葡萄糖量和t時(shí)間產(chǎn)生的葡萄糖量。1.5.1對土壤轉酶動(dòng)力學(xué)參數Km和的影2結果與分析響經(jīng)典米氏方程: V.= X [S]2.1乙醇對土壤轉化酶活性的影響 Km+[]結果顯示,(1)土壤轉化酶活性大小次序為:1經(jīng)數學(xué)變換為:號土樣<2號土樣<3號土樣<4號土樣,其中1和 In S-Kx ([S.]-[S])+4號土樣的土壤轉化酶活性分別為0.77和1.08mg/(g·h),二者相差40.26%(表2)。這表明土壤式中,t為酶促反應時(shí)間;[S]和[S]分別為酶促反轉化酶活性與土壤肥力水平密切相關(guān)。表2不同濃度乙醇對土壤轉化酶活性的影響 Table 2 Invertase activity in soils tested under different concentrations of ethanol mg/)土樣編號乙醇體積分數/% Concentration of ethanol Soil sample051025501000.770.760.70.670.610.5720.920.810.790.800.740.6631.071.130.950.850.740.821.081.110.980.9440.880.83注:100%的乙醇指的是分析純級乙醇 Note: 100% means that ethanol is analytical grade.(2)與對照相比,除3號和4號土樣中加入5%結果類(lèi)似。的乙醇使土壤轉化酶活性升高外,其余濃度乙醇的(3)當乙醇濃度為5%~100%時(shí),隨乙醇濃度加入均導致土壤轉化酶活性降低,當乙醇濃度達到增加,土壤轉化酶活性總體上持續減小(表2)為此100%時(shí),1,2,3,4號土樣的土壤酶活性與各自的乙采用 Speir等[12提出的U=A/(1+B×C)模型,對醇體積分數為0時(shí)的酶活性相比,降幅分別為本研究中的乙醇濃度(C)與轉化酶活性(U)的關(guān)系25.97%,28.26%,23.36%和23.15%(表2)這與進(jìn)行擬合,結果見(jiàn)表3。 Sannino等研究發(fā)現的甲醇對土壤轉化酶的影響表3土壤轉化酶活性與乙醇濃度關(guān)系的擬合結果 Table Regression equation between soil invertase activity and ethanol concentration土樣編號參數 Parameters Soil sampleAB ED10/%0.7520.3770.95629.470.8570.3150.90235.271.04510.4710.7781.0630.3400.90936.28注:自由度n-2=4.0=0.81,ra.01=0.917;表示顯著(zhù)相關(guān);表示極顯著(zhù)相關(guān)表5同 Note: Freedom n-2= 4,. =0. 811,. 0. 917. remarkable correlation, :significant remarkable correlation. Table 5 is the由表3可知,除3號土樣外,其余土樣的U與C用的機理為完全抑制作用包括競爭性的和非競爭 to this table.均呈顯著(zhù)或極顯著(zhù)負相關(guān)表明土壤轉化酶活性受性的抑制作用。乙醇濃度影響顯著(zhù),乙醇對土壤轉化酶活性抑制作(4)土壤酶生態(tài)劑量(Ecological dose)中的第9期王聰穎等:乙醇對土壤轉化酶活性的影響127ED113表示土壤酶活性抑制幅度達10%時(shí)所需要加到100%時(shí),土壤轉化酶的最大表觀(guān)活性急劇降的外界污染物的濃度或劑量,通常也作為土壤受到低,與對照相比,降低了0.105mg/(g·h)。由以上輕度污染時(shí)外源污染物的臨界濃度由表3可見(jiàn),不數據可知,不同體積分數的乙醇對土壤轉化酶活性同土樣間土壤轉化酶的ED1值為29.47%~的抑制作用相差9.55倍,表明在不同底物濃度下,35.27%,最大相差僅為6.81%,表明乙醇對土壤轉乙醇對土壤轉化酶具有明顯的抑制作用?；傅淖饔檬芡寥婪柿Φ挠绊戄^小。此外,要達到輕(3)采用一元一次線(xiàn)性方程對酶活性(U)與乙微污染的程度,5g土樣中要含有1mL體積分數為醇濃度(C)間關(guān)系進(jìn)行了擬合,結果見(jiàn)表5。由表530%~35%的乙醇溶液,這從客觀(guān)上講是不可能的可以看出,乙醇對土壤轉化酶活性具有明顯的抑制這一結果表明乙醇對土壤轉化酶的毒性不強,即乙作用,與前面的規律是一致的,底物濃度的大小并不醇是一種污染效果不嚴重的外源污染物。影響乙醇與土壤轉化酶活性之間的關(guān)系,但其可放2.2底物濃度對乙醇與土壤轉化酶活性關(guān)系的影響大土壤轉化酶受影響的程度。由圖1可知,(1)隨蔗糖濃度增大,土壤轉化酶0.7活性持續增加。當蔗糖濃度從0.010mol/L升高到0.100mol/L時(shí),乙醇濃度為0的土樣中土壤轉化0.6酶活性從0.280mg/(g·h)增大到0.6060.5mg/(g·h),增幅達到53.80%。0.40%;(2)在乙醇濃度相同時(shí),隨底物濃度的增加,土0.3.5%壤轉化酶活性的增加幅度減小采用模型U=A10%;0.225%BC/(1+BC)擬合底物濃度(C)與土壤酶活性0.150%(U)的關(guān)系14,結果見(jiàn)表4,擬合方程得到的A值就0100%是土壤酶的最大表觀(guān)酶活性。由表4可知,不同濃度00.010.0250.050.1乙醇的U和C均達到極顯著(zhù)相關(guān),表明所擬合的方底物濃度(moll Substrate concentration程可較好地揭示二者之間的關(guān)系。最大表觀(guān)酶活性隨乙醇濃度增加呈先增加后降低的變化趨勢,其中圖1底物濃度對乙醇與土壤轉化酶活性關(guān)系的影響乙醇體積分數小于50%的土壤轉化酶最大表觀(guān)活 Fig. Soil invertase activity affected by different concentrations of ethanol and substrate性變幅最高為0.011mg/(gh),而當乙醇濃度增表4土壤轉化酶活性與底物濃度關(guān)系的擬合結果 Table 4 Regression equations between soil invertase and substrate concentration乙醇體積分數/%參數 Parameter Cthanol concentrationAB00.69262.5460.99850.68862.610.998100.64868.67156.1050.998250.701.995500.70340.1130.991001.000注:自由度n-2=4=0.50.990表示顯著(zhù)相關(guān);*,表示極顯著(zhù)相 Note:Freedom n-2=4, ra os =0. 950,. =0. 990: remarkable correlation: .significant remarkable correlation.表5不同底物濃度下土壤轉化酶活性與乙醇濃度的擬合方程 Table 5 Regression equations between ethanol concentration and invertase activities by different substrate concentrations參數底物濃度/(mol/l) Substrate concentration Parameter0.0100.0250.0500.100A0.28030.40660.51380.6052B(10-2)0.0848460.08040.09470.10280.9350.9500.9280.900128西北農林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)第34卷2.3乙醇作用時(shí)間對土壤轉化酶活性的影響示15。反應速度常數k反映反應在本質(zhì)上是“快”還由圖2可知,供試土樣轉化酶活性在乙醇作用是“慢”,其值與底物濃度無(wú)關(guān)。時(shí)間為0min時(shí)最大,此后隨著(zhù)作用時(shí)間的延長(cháng)略由表6可知,(1)與對照(乙醇體積分數為0)相有降低其中1號和2號土樣轉化酶活性的最大降比,隨乙醇濃度的增加,除體積分數5%乙醇處理的幅分別為16.41%和16.0%;3、4號土樣在作用時(shí)間土樣Km略有升高外,其余處理的Km值均有不同為30min時(shí)的酶活性最低,與0min相比,降幅分程度的降低,最大相差達到40%,表明乙醇的加入別為21.56%和0.92%,此后酶活性又有所增加。相導致土壤轉化酶與底物(蔗糖)的親合力增加,酶促關(guān)性分析結果顯示1號土樣轉化酶活性與作用時(shí)反應更易進(jìn)行。但乙醇濃度從10%到100%時(shí),土壤間呈顯著(zhù)負相關(guān)(r=-0.853,n-2=4)表明作用轉化酶酶促反應的Km變化較小,說(shuō)明乙醇濃度的時(shí)間對乙醇與土壤轉化酶活性的影響較小且變化增加對酶與底物的親合力影響較小。規律不強。(2)除體積分數5%乙醇處理的土樣外,其余處理土壤轉化酶酶促反應的Vm均小于對照。由此可no.1 -.NO.2:2.0n.3 *-NO.4知,當乙醇體積分數由10%增加至100%時(shí),土壤轉1.5化酶一底物復合體的解離速度逐漸降低,即乙醇對土壤轉化酶具有非競爭性抑制作用161.0(3)土壤轉化酶酶促反應的反應速度常數k隨0.5乙醇濃度變化而變化的規律性不強。與對照相比,除0乙醇體積分數為5%和100%處理的土壤轉化酶的k值等于或小于對照外,其余處理的k值均大于對100200300時(shí)間/min照,但增幅較小,最大增幅為6.77%表明在本試驗 Time的條件下,乙醇對土壤酶促反應速度影響較小。圖2體積分數50%乙醇作用時(shí)間對土壤(4)不同乙醇體積分數下,土壤轉化酶的Km轉化酶活性的影響與V值呈現極顯著(zhù)的正相關(guān)(r=0.959,n-2= Fig. Soil invertase activity affected by4),表明乙醇減弱了酶促反應中底物與酶的親合力, 50% ethanol at different time增大了酶一底物復合物解離的速度。2.4乙醇對土壤轉化酶動(dòng)力學(xué)特征的影響(5)當乙醇體積分數為5%時(shí),土壤轉化酶的在米氏方程中,米氏常數Km表征酶與底物結Km和值均比對照及其余處理增大但其酶活合的牢固程度,當Km值小時(shí),酶與底物結合牢固,性與對照相比卻減小,說(shuō)明體積分數5%的乙醇增親合力大;最大反應速度Vmx是總酶量的量度,可表大了酶一底物復合物解離的速度,最終導致土壤轉征酶底物復合物分解為酶和產(chǎn)物的速率,對土壤來(lái)化酶活性降低?？梢?jiàn)酶動(dòng)力學(xué)參數從多方面揭示了講其是土壤實(shí)現某種酶過(guò)程的潛在能力的容量指土壤酶促反應機理等方面的差別。表61號土樣轉化酶酶促反應的動(dòng)力學(xué)參數 Table 6 Kinetic parameters of invertase of No. I soil tested Ethanol concentration (umol-L-.g-.h)Km/(mmol·l-1k/(10-5)0.46619.731.1370.608500.49222.161.1370.5670.39711.851.2140.837250.40413.251.1840.769500.43414.161.1969741000.39914.151.1000.90.986注:自由度為n-2=14,r.=0.497r0.01=0.623,示顯著(zhù)相關(guān)表示極顯著(zhù)相關(guān) Note Freedom n-2=14. 0. 497, a. # 0. 623; remarkable correlation; . significant remarkable.3結論活性,乙醇濃度與土壤轉化酶活性呈顯著(zhù)或極顯著(zhù)相關(guān),底物濃度可放大這種抑制作用;乙醇對土壤轉本試驗結果表明,乙醇可明顯抑制土壤轉化酶化酶活性的抑制作用為完全抑制作用,包括競爭性第9期王聰穎等乙醇對土壤轉化酶活性的影響129和非競爭性抑制;乙醇的作用時(shí)間對土壤轉化酶活來(lái)看,乙醇是土壤中的一種輕度污染物。性有影響,但規律性不強所以從土壤生態(tài)毒理角度參考文獻] [1] Burns R G. 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The ethanol concentration and soil invertase activity are remarkably or significantly correlated in three samples. Their mechanism in- cluded direct inhibition. The ecological dose values (ED were calculated, ranging from 29. 47% to 35.27%, it shows that ethanol is a lightly toxic pollutant The substrate concentration can enlarge the influencing extent. With ethanol input, soil invertase kinetic parameters Km and values decreased, so the reaction mechanism is a kind of total inhibition between ethanol and invertase, including no-competitive and competitive. Key words: ethanol soil invertase activity kinetic characteristic; reaction mechanism