一種新型枝化聚乙二醇的合成

007年第15卷合成化學(xué)Vol.15,2007第2期,216~218Chinese Journal of Synthetic ChemistryNo.2,216~218快遞論文種新型枝化聚乙二醇的合成王孝杰,李效東,劉克良1.國防科技大學(xué)航天與材料工程學(xué)院湖南長(cháng)沙4100732.軍事醫學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所北京100850)摘要:以谷氨酸作為中心分子首先對谷氨酸的氨基進(jìn)行Bo保護然后在4-二甲基氨基吡啶-二環(huán)己基碳二亞胺催化體系的作用下將兩條線(xiàn)性的單甲氧基聚乙二醭mPEG)鏈連接到谷氨酸的兩個(gè)羧基上合成出含有兩條聚乙二醇PEG)鏈及一個(gè)活性氨基的新型枝化PEGl(PEG)2]其結構經(jīng)HNMR,IR,GPC和VPO表關(guān)鍵詞:枝化聚乙二醇;活性氨基;氨基保護;合成中圖分類(lèi)號:0623.4;063文獻標識碼:A文章編號:1005-1511(2007)202160Synthesis of a Novel Branched Polyethylene GlycolWANG Xiao-jie, LI Xiao-dong, LIU Ke-liang(1. College of Aerospace and Material EngineeringNational University of Defence Technology Changsha 410073, China2. Institute of Pharmacology Toxicology Academy of Military Medical Science, Beijing 100850, ChinaAbstract: A novel branched polyethylene glycol[ Glu( PEG h], which consists of two PEG chainsand a glutamic acid( Glu with a active amido protected by t-butyloXvcarhonlyl( Boc), was synthesized. Two linear PEG chains in Glu( peg)were linked up through two carboxylic group of the gluby using 4-dimethylaminopyridine -dicyclohexylcarbodiimide as a catalytic system. The structureGIu PEG ) was confirmed by H NMR, IR, GPC and VPOKeywords: branched PEG active amido amido protected synthesis在當今的藥物傳送領(lǐng)域聚乙二醇(PEG)修具有特殊結構的PEG被稱(chēng)為枝化PEG4。和線(xiàn)飾是一類(lèi)被廣泛使用的重要方法特別是在改善性PEG相比枝化PEG不僅可以最大限度地保蛋白質(zhì)及多肽藥物的臨床應用方面被認為是目前留被修飾后藥物的生物活性6而且其特有的最成功的技術(shù)之_1-31。該技術(shù)在實(shí)際應用中存“類(lèi)傘型”結構可以更有效地保護蛋白質(zhì)在體內在一些問(wèn)題主要表現在蛋白質(zhì)藥物在PEG修飾不被水解能更有效地阻止抗體接近蛋白質(zhì)藥物后通常會(huì )導致其生物活性大大降低。近年來(lái)的研從而大大增加蛋白質(zhì)藥物在體內的循環(huán)半衰期,究表明當采用一種具有特殊結構的PEG進(jìn)行修中國煤化工疫源性7飾時(shí)可以眀顯降低修飾后藥物的活性損失這種CNMHG用的枝化PEG主要是收稿日期:2006-07-12作者簡(jiǎn)介:王孝杰1970-)男漢族湖南長(cháng)沙人在讀博士主要從事大分子合成的研究。Te.0731-7646668,E-mail:yj605第2期王孝杰等:種新型枝化聚乙二醇的合成217NH,HBOcNaoH, THF/H, oBu'--000-Bu' HocCOHHO CCO2 HBoc )0GluHBOcmPEG DCC-DMAP, CH CIPEGO2CCO PEGGlu( peg hcheme 1以賴(lài)氨酸(Ⅰys)為中心分子的二枝化 PEGI LyS ACROS公司叔丁氧羰基酸酐(Boc)O]吉爾生(PEG)j11。L(PEG)2在修飾蛋白質(zhì)時(shí)是以化斗二甲基氨基吡啶(DMAP)吉爾生化;二環(huán)蛋白質(zhì)上的氨基作為修飾位點(diǎn),雖然通過(guò)氨基修己基碳二亞胺(DCC)吉爾生化淇其余所用試劑飾蛋白質(zhì)是迄今為止最常用的方法而且通常也均為國產(chǎn)分析純試劑,使用前經(jīng)干燥處理是在對蛋白質(zhì)進(jìn)行PEG化時(shí)被采用的首選方案但這種方法也存在不足最突出的問(wèn)題就是由于1.2合成蛋白質(zhì)分子中可反應的氨基通常不止一個(gè)而使產(chǎn)1)1的合成物中存在大量的異構體而這種異構體的混合物在燒瓶中加入Glu1.47g10mmol),水10通常是很難分離純化的。為此目前的PEG化技mL,THF20m及1 mol. L NaOH溶液10ml,術(shù)在向著(zhù)定點(diǎn)修飾”方向發(fā)展即修飾劑只在指攪拌使其溶解后加入(Boc02.62g12ml)定的位點(diǎn)發(fā)生反應。定點(diǎn)修飾不僅可以大幅度降于室溫反應48h(反應中不斷用1molL低產(chǎn)物中異構體的生成而且還可以通過(guò)設計蛋NaOH調節pH7-8反應液減壓蒸餾至10白質(zhì)分子上被修飾位點(diǎn)的位置來(lái)盡可能地保留其mL用1 mol. L HCL調pH2~3用乙酸乙酯藥物活性。3×20mL)萃取合并有機相用硫酸鈉干燥減本文合成了一種新型的枝化PEG[GH壓蒸餾,真空干燥得凝膠狀透明固體1,產(chǎn)率PEG)2, Scheme1]。使用谷氨酸(Glu)作為中心核分子通過(guò)Gu上的兩個(gè)羧基連接兩條線(xiàn)性(2)Gu(PEG)2的合成的mPEG鏈。Glu的氨基通過(guò)叔丁氧羰基(Boc)在燒瓶中加入11.0g4mmol),mPEG6.0保護得1去保護后氳基可以方便地轉化為馬來(lái)g8mmol),DCC1.6(8mmol)及DMAP0.2g酰亞胺基團該基團對半胱氨酸上的巰基進(jìn)行修(1.6mmol)攪拌下于室溫反應5h。過(guò)濾除去飾是蛋白質(zhì)修飾化學(xué)中最有效的定點(diǎn)修飾手段之不溶物濾液經(jīng)1molL-Na2CO3及飽和NaCl作為后期修飾蛋白質(zhì)時(shí)的反應位點(diǎn)。該方溶液洗滌硫酸鈉干燥減壓蒸餾真空干燥得白法合成路線(xiàn)簡(jiǎn)單成本低所得產(chǎn)物修飾特異性色固體(PEG點(diǎn)產(chǎn)率80%; H NMR:1.44強具有很高的應用價(jià)值。相關(guān)研究國內外尚未(s,9H,CH13),2.2m,4H,CH2ofCu),3.38見(jiàn)文獻報道(s,6H,OCH3),3.64(m,132H,OCH2CH2)4.28(s,4H,CO2CH2)1實(shí)驗部分2結果與討論1.1儀器與試劑Varian inova-300型核磁共振儀(CDCl3為中國煤化工譜圖見(jiàn)圖1。由于1溶劑TNS為內標); Nicolet Mangna IR50型紅有CNMHG的171xC=0)cm外光譜儀(KBr壓片); Waters 15152414型凝膠處出現很強的吸收,此峰在Cn(PG)2中卻消滲透色譜儀(簡(jiǎn)稱(chēng)CPC,THF為溶劑); NAUER失表明1上的兩個(gè)羧基反應了。而在GK-7000型蒸汽壓力滲透儀簡(jiǎn)稱(chēng)VPO(PEG)2譜圖中卻出現了1740C00)cm-強吸mEG(Mn=750), ACROS公司;Clu,收表明線(xiàn)性mPEG通過(guò)酯鍵與Gu連接起來(lái)218合成化學(xué)Vol.15,2007l098cm-處有較強的吸收,該處是醚鍵(C-參考文獻0-C)的伸縮振動(dòng)吸收峰這是由于PEG鏈中存在大量的醚鍵導致的(1715,1603,1250)11 Harris J M, Martine, Modi M. Pegylation A novelm處的吸收分別是氨基甲酸N-CO-0)基團process for modifying pharmacokinetic J]. Clin Phar-macokinet 2001 A0 539-551的對稱(chēng)及不對稱(chēng)吸收這一組峰是由Boc-HN產(chǎn)2] Kartre K. The conjugation of proteins with poly ethyl-生的(1452,1362)cm處的吸收為叔丁基的ene glycol ) and other polymers[ J ] Adv Drug deli特征吸收是由Boc上的叔丁基引起的。所有的Rev19931091-114數據與枝化PEG的分子結構相吻合。[3] Walsh G. Second-generation biopharmaceuticals[ J]Eur J Pharm Biopharm 2004 58: 18honomethoxypol( ethylene glycol ) for protein modificatort J Bioconjugate Chem 1995 6 62[5]VeFM Pasut G. Pegvlatfulproach to drug delivery[ J ] Drug Discovery Today200510:1451-1458[6] Veronese F M, Caliceti P, Schiavon O. Branched andlinear poly( ethylene glycol IJ Bioactive CompatiblePolym 1997 12 1圖11和Gl(PEG)的IR譜圖[7] Caliceti P, Schiavon O, veveroneseF M. Immunologicalra of 1 and Gl PEG hproperties of uricase conjugated to neutral soluble pol圖2為G(PEG)2的GPC圖。GPC譜圖結ymer[ J ] Bioconjug Chem 2001 12 515-52果表明產(chǎn)物中有兩種物質(zhì)其中主要產(chǎn)物的相對[8]mne. ontardinI C, caliceti:amprovement of pharmacokineticurological and sta分子量峰值為1995次要產(chǎn)物的相對分子量峰值bility properties of asparaginase by conjugation to line為927經(jīng)分析其中主要產(chǎn)物是 Glu( peg)次要ar and branched monomethoxypoly ethylene glycol產(chǎn)物為只連接了一條鏈的不完全產(chǎn)物。根據峰面[ J] Control Release 1996 A0199-209積比例計算Clu(PEG)2的含量為80%。由于[9] Andrea g, Michela p,Cias,rtal. An improvedprocedure for the synthesis of branched polyethylene對值所以所得結果與真實(shí)值之間存在一定的偏glycol( PEGs with the reporter dipeptide met-BAla差。過(guò)柱純化后經(jīng)VPO測試結果表明主要產(chǎn)物for protein conjugation[ J ] Bioorg Med Chem Lett的數均分子量為1783。由于原料mPEG本身的200212:177-180.分子量具有一定的分散度所以所測結果與C[101 Caliceti P, Veronese F m. Pharmacokinetic and bio-PEG)2的分子量理論值為1712)較為吻合。distribution properties of poly( ethylene glycol )-pro-tein conjugates[ J ]. Adv Drug Deliv Rev 2003 551995[ 11] Andrea G, Mirta C, Michela P, et al. Anchimericassistance effect on regioselective hydrolysis ofbranched PEGs[ J ] Bioorg Med Chem 2004, 12M I. Bentley M D, Harris J M. Chemist中國煤化工8.018020.0gelation[ J ]. Adv drug deMinutesCNMHG76圖2PEG2的GPC譜圖igure 2 GPC spectrum of PEG,