注銀熱解碳的抗菌機理研究

第28卷第2期天津師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)Vol 28 No. 22008年4月Journal of Tianjin Normal University (Natural Science Edition)Apr.2008文章編號:1671-1114(2008)02-0031-04注銀熱解碳的抗菌機理研究才學(xué)敏,鄭津輝,趙杰(天津師范大學(xué)a,物理與電子信息學(xué)院;b化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,天津300387)摘要:使用革蘭氏陽(yáng)性繭——一金糞色葡萄球菌,對注銀熱解礦的抗菌機理作了探討分析.銀離子的注入能量為70keV,注入劑量分別為5×10“,1×10“,5×10uion/cm2.用俄歇電子能譜(AES)和X射線(xiàn)光電子能譜(XPS對樣品袁面進(jìn)行了擻觀(guān)分析.結果表明:樹(shù)料表面形成了富銀層;對注銀劑量相的熱解礦,直接接觸的擾菌效果比其濾液的抗菌效果好,說(shuō)明注銀熱解碳的抗菌作用是溶出的銀離于和未溶出的材料表面絡(luò )合狀銀離子的共同抗酋結果,且殺酋以銀離子溶出為主,關(guān)鍵詞:熱解碳;銀高子注入;抗菌機理中圖分類(lèi)號:R318.08;O484.1文獻標識碼:AOn bactericidal mechanism of pyrolytic carbon with silver implantedCAl Xuemin, ZHENG Jinhui, ZHAO J(a. College of Physics and Electronic Informationb. College of Chemistry and Life Science, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China)Abstract: By using Staphylococcus aureus which is a kind of Gram-positive bacteria the bactericidal mechanism of pyrolytic carbon with silver implanted is studied. Energy of silver ions implanted is 70 keV, and doses of that are 5x10,1x10,5X10 ions/cm. By using Auger Electron Spectroscopy and X-ray Photoelectron Spectroscopy thesurface microstructure of samples is analyzed. The results show that Ag-rich layer is formed on the surface of material. For the pyrolytic carbon samples with same dose of silver implanted the bactericidal effect of touching directly isbetter than that of its filtrate. It means that the dissolved silver ions and the complex silver ions on the surface ofmaterial resist bacteria jointly, and the dissolved silver ions play the more important role.Key words: paralytic carbon; silver ion implantation; bactericidal mechanism生物醫學(xué)材料是生物系統直接作用于組織或器因此熱解碳具有抗斷裂強度高和相對低的彈性模官的治療、增強或替代的材料.因而須要滿(mǎn)足各種量以及相當好的耐磨和耐疲勞性能;(3)熱解碳具生物功能對材料理化性質(zhì)的要求且不會(huì )因與生物有無(wú)刺激不致癌的特性?huà)伖夂蟮臒峤馓纪繉泳哂邢到y直接結合而減弱其功能和使用壽命.人工心臟致密不透性,不會(huì )引起降解反應;(4)熱解碳還具有瓣膜是指用機械或者生物組織材料加工而成的可以罕見(jiàn)的抗血凝性能,可直接應用于心血管系統這也用來(lái)代替病損心臟瓣膜功能的人工器件.目前,由正是熱解碳十分流行的最主要原因口.另外銀作為一種優(yōu)良的抗菌劑,自古至今已有廣泛的應用它于制造機械瓣葉最流行的材料是低溫各向同性碳在手術(shù)過(guò)程中及術(shù)后均能起到很好的抗菌作用LTIC)簡(jiǎn)稱(chēng)熱解碳.(1)醫用碳素材料與其他金本研究是在注銀熱解碳具有明顯抗菌性研究的屬材料相比,是一種化學(xué)惰性材料故熱解碳具有很基礎上(,對材料表面進(jìn)行AES和XPS的微觀(guān)分好的生物相容性,在體內不會(huì )產(chǎn)生對機體有害的離析用平板菌落計數法進(jìn)行抗菌效果的測試初步探子;(2)醫用碳素材料具有良好的“生物力學(xué)性能”,討了注銀熱解碳的抗菌機理收稿日期:2007-10-30基金項目:國家自然基金資助項目(10475061);天津市自然科學(xué)基金資助項目(03360791)第一作者:才學(xué)敏(1983-),女,碩士研究生通訊作者:趙杰(1943-),男教授從事凝豪態(tài)物理、離子注入方面的研究. E-mail; jiezhao1943@126.cm天津師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)2008年4月1實(shí)驗其2倍濃度的細菌懸液b.用微量加樣器取菌液a各1mL,分別加入無(wú)菌真空盒(培養盒)的各孔中.再從1.1實(shí)驗樣品的制備已滅菌的樣品組中各取半份量的樣品,分別放入已實(shí)驗所使用的高純熱解碳人工心臟瓣膜其中加菌液a的各個(gè)孔中并編號;用微量加樣器取菌液的S含量為0.01%,石墨相含量為24%其他雜質(zhì)b各0.5mL,分別加入培養盒的各孔中,取步驟1)含量均小于0.001%.使用北京師范大學(xué)低能核物中的每組樣品濾液各0.5mL,分別加入已加菌液b理所研制的金屬蒸汽弧源( MEEVA)離子注入機進(jìn)的各個(gè)孔中并編號行銀離子注入.樣品雙面注銀的編號和注入參數見(jiàn)3)把步驟2)中的培養盒放入轉速為150r/min表1.的搖床上,恒溫37°C,培養24h.衰1樣品編號及其注入參數4)用微量加樣器取與樣品及樣品濾液共培養后樣品編號R/mmE/keVI/m注入劑量/的菌液,從每個(gè)編號孔中各取0.1mL,接種于已滅(ion·cm-2)菌的含培養基的培養皿中,每個(gè)編號樣品各3個(gè)平5X1014行操作,均勻涂布平板后,平放于實(shí)驗臺靜置20~1X101630min,使菌液滲人培養基表層內.將標明相應編號的培養皿放人37°C的恒溫箱里培養24h1.2樣品結構特征測試5)用體視顯微鏡觀(guān)察,并用數碼相機記錄培養1.2.1AES測試采用美國PH公司生產(chǎn)的PH-610掃描俄歇m里的菌落數按下式計算各個(gè)樣品的抗菌率電子能譜儀,分析樣品表面的成分及薄膜成分沿深K=A×100%度的變化.采用同軸電子槍和CMA能量分析器,其中,A,B分別對應相同面積內未注銀對比樣品其電子槍高壓能量為3keV,能量分辨率為0.3%,和注銀樣品與細菌作用之后培養皿里的菌落數入射角30°,分析室真空度為5.2×10-7Pa.深度分析中離子束的濺射條件為:掃描型Ar離子槍面積2結果與討論為1mm×1mm,濺射速率約為30mm/min,能量為2.1注銀熱解碳的結構特征分析3.0keV,發(fā)射電流為25mA2.1.1AES分析1.2.2XPS測試樣品A3(注銀劑量為5×10ion/cm2)的銀隨利用美國PH公司生產(chǎn)的型號為PH5300X光深度分布的AES譜圖見(jiàn)圖1,曲折的曲線(xiàn)為實(shí)驗測電子能譜儀對注銀劑量5×10"ion/cm2熱解碳樣品量值,光滑曲線(xiàn)為高斯擬合后的曲線(xiàn),由圖1可以進(jìn)行表面元素分析的定性、半定量、化學(xué)價(jià)態(tài)分析.看出,銀的分布為非對稱(chēng)的高斯分布,其最大濃度為分析室真空度優(yōu)于1.3×10Pa,用于對樣品進(jìn)行清4.5%注人深度為750mm左右.銀元素濃度的高潔和定量剝離的離子源的濺射速率為1nm/min,斯分布都向靶材表面發(fā)生了偏移,這主要是由于離Ar+能量為3.5keV,束流為25mA子注入時(shí)的濺射效應,使得靶材料表面向內部有了1.3抗菌試驗遷移,從而使高斯分布相對向表面遷移,導致了注入采用平板菌落計數法進(jìn)行抗菌性能測試.平板離子的非對稱(chēng)高斯分布菌落計數法是將待測樣品經(jīng)適當稀釋,使其中的微生物充分分散成單個(gè)細胞.取一定量的稀釋樣液接種到平板上,經(jīng)過(guò)培養,由每個(gè)單細胞生長(cháng)繁殖而形FFT Filter成肉眼可見(jiàn)的菌落,即每一個(gè)單菌落代表原樣品中一個(gè)單細菌.統計菌落數根據其稀釋倍數和取樣接種量即可換算出原樣品中所含的菌數.本實(shí)驗選用的菌種為金黃色葡萄球菌,具體步驟如下:1)從已滅菌的樣品組A,A1,A2,A中各取等量樣品,加入磷酸鹽緩沖液(PBS)1mL,放在轉速圖1樣品A3的銀元素隨深度分布圖為150r/min的搖床上,恒溫37°C,24h之后,將樣2.1.2XPS分析品取出,得到濾液圖2是樣品A(注銀劑量為5×107ion/cm2)2)用PBs制成細菌懸液a及表面的XPS譜圖.由圖2可知,熱解碳第28卷第2期才學(xué)敏,等:注銀熱解碳的抗菌機理研究·33表面富銀,在能量為275eV處有很強的Cls峰,對步驟(5)給出的公式計算各樣品的抗菌率(表2)應熱解碳的基底;在能量375eV處對應著(zhù)較強的銀2各組樣品抗菌率的Ag3d峰.同時(shí),在600eV左右還有Ag3p,樣品編號K樓/%K/為Ag3p3峰,說(shuō)明表面存在不同價(jià)態(tài)的銀,可能有Ag,AgO,Ag2O,Ag2CO等.表明注銀樣品表面確實(shí)存9580在不同價(jià)態(tài)的銀,富銀的表面具有抗菌作用.從表2可以看到,注銀熱解碳具有明顯的抗菌效果,且無(wú)論對于直接接觸還是間接接觸,抗菌率均隨注銀劑量的增大而增大;對于注銀劑量相同的樣2X103品,直接接觸的殺菌效果比間接接觸(濾液)的殺菌效果好;對于樣品A3無(wú)論直接接觸還是間接接觸,殺菌效果均為100%可能當注銀劑量達到一定程度,濾液中的銀離子可使等量的細菌全部殺死2.3注銀熱解碳的抗菌機理圖2樣品A表面的XPS譜圖由上述抗菌試驗結果分析可知間接接觸的方式2.2抗菌試驗結果也同樣具有較好的抗菌效果,說(shuō)明注銀熱解碳的濾液2.2.1定性觀(guān)察與分析具有抗菌作用,即材料中溶出的Ag起抗菌作用;對抗菌試驗結果的部分照片如圖3所示于注銀劑量相同的樣品,抗菌材料直接接觸菌液比其濾液接觸具有更強的抗菌作用,說(shuō)明注銀熱解碳直接接觸菌液時(shí)除了溶出的Ag起抗菌作用外,材料表面未溶出的絡(luò )合狀銀離子也有抗菌活性;這些說(shuō)明注銀熱解碳的抗菌作用是銀離子溶出抗菌和接觸抗菌共同作用的結果,且殺菌以銀離子溶出為主對于注銀熱解碳的抗菌效果直接與銀離子從熱解碳中的溶出有關(guān)溶出量的多少決定了抗菌效果對于一定注銀劑量的熱解碳銀離子的溶出量直接決定于熱解碳的微觀(guān)結構和溶出時(shí)間.該材料表面的SEM形貌的實(shí)驗結果表明熱解碳表面為多孔的層A。對應未注銀樣品狀結構,該結構使材料的表面積增大注入的銀更容A2對應注入劑量為1×10ion/cm2的樣品易從材料中游離出來(lái),同時(shí)也擴大了細菌與材料的接A3對應注入劑量5X10uion/cm2的樣品A對應注入劑量為1×10ion/cm2的樣品濾液觸面,因而具有很好的殺菌效果.通過(guò)24h和42h圖3對應樣品A、A2、A2、A的菌落圖片的樣品濾液殺菌效果對比,后者的抗菌效果明顯優(yōu)于前者.表明給予的溶出時(shí)間越長(cháng),抗菌效果越好.由圖3可知,沒(méi)有注銀的樣品A。沒(méi)有抗菌效從生理學(xué)的角度研究銀離子的抗菌機理是一個(gè)果,可見(jiàn)有大量的菌落分布;樣品A2和A3均具有十分復雜的問(wèn)題雖然人們已經(jīng)進(jìn)行過(guò)大量的研究,很好的抗菌效果,且樣品A3的抗菌效果更好,幾乎但對殺菌的具體生理過(guò)程尚未全面了解目前,主要看不到菌落.樣品A2的直接接觸和間接接觸A2有3種有關(guān)銀的抗菌機理(樣品濾液)均具有較好的抗菌效果,但直接接觸的第一種是銀離子溶出型抗菌機理.細菌在生存殺菌效果比間接接觸的殺菌效果好.在未注銀的對環(huán)境中當銀離子濃度相對過(guò)高時(shí)會(huì )影響其生長(cháng)繁照樣品A中細菌的存活性很好,在顯微鏡下看到殖,從而起到殺菌作用.初級的破壞作用體現在:當的粘稠的白色物質(zhì)是細菌新陳代謝旺盛的產(chǎn)物,而細菌膜外存在高濃度的銀離子時(shí),改變了正常的生注銀樣品則沒(méi)有,表明銀抑制了細菌的新陳代謝使物膜內外的極化狀態(tài)并引起新的離子濃度差,從而其無(wú)法正常生長(cháng)阻礙或破壞細胞維持生理所需的小分子和大分子物2.2.2樣品抗菌率的定量分析質(zhì)的運輸.更深入的破壞作用體現在:當微量銀離統計對應各個(gè)樣品培養皿中的菌落數,通過(guò)實(shí)驗子到達細菌細胞膜時(shí),因細胞膜帶有負電荷銀離子天津師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)08年4月能依靠庫侖引力牢固吸附細胞膜,與膜蛋白結合,導法逆轉.這是因為細菌不具備高等動(dòng)物完整的細胞致細胞立體結構損傷,產(chǎn)生功能障礙但細菌此時(shí)仍骨架及快速的修復功能從而造成最終的損傷,具有一定的生命力;當銀離子聚集量達到一定程度時(shí),它會(huì )穿透細胞壁進(jìn)入細胞內部與蛋白質(zhì)核腰3結論中存在的巰基(一SH)、亞氨基(一NH一)等含硫、1)由AES和XPS測試與分析得出,注銀熱解含氮官能團發(fā)生反應,甚至破壞或置換維持酶活力碳表面含微量銀,且呈不同價(jià)態(tài),銀隨深度的分布為所必需的金屬離子,如Mg,Fe和Ca2+等,使細非對稱(chēng)的高斯分布,正是富銀的表面起著(zhù)抗菌作用菌的蛋白質(zhì)沉淀或失去活性,造成固有成分被破壞2)注銀熱解碳直接接觸的抗菌率和其濾液的抗或產(chǎn)生功能障礙而導致細菌死亡.當菌體被銀離子菌率均隨注銀劑量的增大而增大;對于注銀劑量相殺滅后銀離子還可以從細菌中游離出來(lái),又和其他同的樣品抗菌效果前者較后者更好說(shuō)明注銀熱解細菌作用,如此周而復始,使其具有持久抗菌性碳的抗菌作用是溶出的銀離子和材料表面未溶出的其反應如下絡(luò )合狀銀離子的共同抗菌結果,且殺菌以銀離子溶蛋白質(zhì)-SH+Ag+蛋白質(zhì)-SAg↓+H+;出為主;當注銀劑量達到一定程度,如樣品A3注入蛋白質(zhì)、核酸-NH+Ag+→劑量為5×10ion/cm2時(shí),兩者的抗菌作用是相同蛋白質(zhì)、核酸-NAg↓+H+的,均為100%從外形上觀(guān)察,細菌質(zhì)壁分離,細胞壁失去完整3)注銀熱解碳的抗菌效果直接與銀離子從熱解性和對滲透壓的保護作用,細胞膜破裂,組織液外碳中的溶出有關(guān),抗菌率與溶出時(shí)間成正比此外,流,細菌凋亡.這源于菌體內有大量中毒顆?？勺y熱解碳的多孔層狀結構,方便了銀離子的溶出能是菌體內大量蛋白質(zhì)變性沉淀的結果和細菌的吸附,因而具有良好的抗菌效果.第二種是銀的接觸抗菌機理.注銀熱解碳表面參考文獻是富銀層,由于A(yíng)g未飽和的配位能力,通過(guò)靜電吸[1]盧永要,崔振鐸,楊賢金,等,各種材料在人工心臟瓣膜中的附周?chē)h(huán)境中的細菌,與菌體表面的N或O作用,應用[門(mén).金屬熱處理,2004,29(9):23-26破壞菌體表面活性結構導致菌體因生理變化或活21郭希銘,劉謙祥,唐慧琴,等銀離子注人對TN薄膜和熱解動(dòng)受阻而死亡碳抗性能的影響[冂],天津師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,第三種是光催化抗菌機理在光的作用下,材[3]劉櫚,唐琴,張魁,等銀離子注人TN薄膜的抗菌性和抗料表面的微量銀起到催化活性中心的作用激活水腐蝕性研究[.天津師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2007,27(1)和空氣中的氧,產(chǎn)生羥基自由基(OH)及活性氧離13子(O),而活性氧離子具有很強的氧化能力,能在[4唐慰琴,鄭律輝,劉銅,等銀離子注人熱解碳的抗菌性研究幾短時(shí)間內破壞細菌的增殖能力,致使細胞死亡,從而真空科學(xué)與技術(shù)學(xué)報,2006,26(2):93-9達到抗菌的目的因為銀離子本身并不消耗,只起催[5]沈萍,范秀容,李廣武微生物學(xué)實(shí)驗(3M.北京:高等教育出化劑的作用,所以也具有持久的抗菌效果[6]夏金蘭,王春,劉新星.抗菌劑及其抗菌機理[幾中南大學(xué)學(xué)報此外,銀的抗菌作用與自身的化合價(jià)態(tài)有關(guān),抗自然科學(xué)版,2004,35(1):31-37.菌能力按下列順序遞減:Ag+≥Ag+≥Ag+.蛋7]馬玉龍,許榮離子型無(wú)機抗菌材料研究進(jìn)展材料導報白質(zhì)以膠體的形式在菌體中存在,高價(jià)銀離子比低價(jià)銀離子使膠體凝聚的效率大,蛋白質(zhì)沉淀也就更[8] Feng Q L, Wu J, ChenGQ e al a mechanistic study of the anti-cterial effect of silver ions on Excherichia aoli and Staphylococcus容易,抗菌作用也越強.此外,高價(jià)態(tài)銀的還原勢極aureus[]. J Biomed Mater Res, 2005, 26: 662-668高并容易使體系產(chǎn)生原子氧,產(chǎn)生高效抗菌作用.[9]周祚萬(wàn)楚瓏晨,段小飛.無(wú)機抗菌材料的產(chǎn)業(yè)化現狀門(mén)新材曾用小鼠成纖維細胞L929作過(guò)注銀熱解碳的細料產(chǎn)業(yè),2003,6:20-23.胞毒性研究試驗表明銀離子對細胞的毒性很小,為[10]唐墓琴,劉欣,劉銅,等注銀熱解碳生物相容性的研究[0級或1級,這對高等動(dòng)物來(lái)說(shuō),可以認為是無(wú)毒功能材料2006,37:680-683[11] Gupta Amit, Matsui Kazuaki, Lo Jengfan, et al. Molecular basis的.然而,對于細菌卻表現出極強的抗菌性,目前已有for resistance to silver cations in Salmonella]. Nature Medicine研究者在沙門(mén)氏菌和大腸桿菌中發(fā)現抗銀基因1,1999,5(2);183-188這些基因表達的最終產(chǎn)物大多是膜蛋白,在轉錄調整12] Shver smor. Bacterial silver resistan; Molecular biology and系統的控制下完成對銀離子的綁定搬運,最終將銀uses and misuse of silver compounds [J]. FEMS MicrobiologyReviews,203,27:341-353.離子排出胞外.但是,銀離子的強抗菌作用,依然無(wú)