生物法拆分α-苯乙醇

第40卷第2期應用化工VoL 40 No. 22011年2月Applied Chemical IndustryFeb.2011生物法拆分α-苯乙醇李冬桂,馬麗,劉雄民,蔡福寧(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西南寧530004)要:從土壤中篩選出一株能高效選擇性氧化(S)-(-)1苯乙醇的菌株了13,初步鑒定為草酸桿菌( Oxalobacteraceae即p.)。將其用于不對稱(chēng)氧化拆分消旋a-苯乙醇的反應。研究表明,菌株 oralobacteraceae即p.KI3適合的催化拆分條件為:碳源、氮源分別為糊精和蛋白胨發(fā)酵?2h,a苯乙醇質(zhì)量濃度為4g/L反應體系初始pH=6,30℃反應72h在此條件下,(S)-(-)-1苯乙醇的轉化率為9863%,(R)-(+)-1-苯乙醇對映體過(guò)量值ee98.01%。關(guān)鍵詞:選擇性催化;a苯乙醇;性拆分中圖分類(lèi)號:TQ033文獻標識碼:A文章編號:1671-3206(2011)02-0239-04Biological resolution of a-phenyl ethanolLI Dong-gui, MA Li, LIU Xiong-min, CAl Fu-ningSchool of Chemistry Chemical Engineering, Guangui University, Nanning 530004, China)Abstract: The strain JX13 which can catalyze the oxidation of (S)-(-)-l-phenyl ethanol selectively wasscreened from soil. It was identified as Oxalobacteraceae sp. The appropriate conditions for the reactionwere a-phenyl ethanol 4.0 g/L, pH =6.0, 30 C, reaction time 72 h, dextrin as carbon source and pep-tone as nitrogen source The conversion of (S)-(-)-1-phenyl ethanol and the enantiomeric excess of(R)-(+)-I-phenyl ethanol with strain JX13 were up to 98.63% and 98.01%, respectivelyKey words: selective catalysis; a-phenyl ethanol; chiral resolution含芳香基的光學(xué)活性醇是天然產(chǎn)物及手性藥物貴。以微生物整體細胞代替酶進(jìn)行外消旋芳合成中重要的手性中間體,手性醇的兩個(gè)對映體基仲醇的氧化還原拆分,可以利用微生物活性細胞在手性藥物合成中可用來(lái)創(chuàng )造最初的手性中心。生內的代謝過(guò)程使輔酶再生,免去了添加輔酶及氧化命體系對手性藥物中不同構型的立體異構體會(huì )表現還原酶復雜且昂貴的分離過(guò)程,有利于保持細胞內出不同程度的生理效能23。因此人們更著(zhù)眼于使氧化還原酶的催化活性。草酸桿菌能參與草酸用高光學(xué)純度的單旋體作為特效藥。代謝主要用于抑制尿結石的形成1。目前利目前,微生物細胞催化不對稱(chēng)還原潛手性酮和用草酸桿菌整體細胞氧化拆分a苯乙醇的方法尚生物法拆分手性醇是獲得單一對映體手性醇的兩種未見(jiàn)報道重要途徑。利用酯酶或脂肪酶催化外消旋仲醇的對本研究采用了微生物細胞氧化法拆分a苯乙映選擇性酯化或轉酯化拆分及外消旋酯的對映選擇醇篩選出一株能催化選擇性氧化(S)(-)1苯乙性水解拆分是生物法拆分手性醇的一種方式,目醇為苯乙酮的菌株 Oxalobacteraceae s.D13,從而前已有較多文獻報道。但轉酯化拆分需先合成得到(R)(+)1苯乙醇,并對拆分反應條件進(jìn)行了不對稱(chēng)酯,伴有副反應發(fā)生。利用氧化還原酶催化優(yōu)化研究。的方法將外消旋芳基仲醇的一個(gè)對映體氧化為芳基1實(shí)驗部分酮同樣可以實(shí)現外消旋的芳基仲醇的拆分。這11試劑與儀器過(guò)程往往需要輔酶的參與,而這些輔酶非常昂a-苯乙醇(質(zhì)量分數9%),優(yōu)級純;乙腈收稿日期:2010-1207修改稿日期:010-1214基金項目:廣西應用基礎研究專(zhuān)項資助項目(桂科基0832002);廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計劃項目(桂科攻109012)作者簡(jiǎn)介:李冬桂(1985-),女(瑤族),廣西桂林人,廣西大學(xué)在讀碩士研究生師從馬麗高級工程師從事香料化學(xué)方面的研究。電話(huà)0771-3270732E-mail:ldg1985@163.cm240應用化工第40卷為色譜純;葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、K2HPO4、表1菌株的篩選MSO4·7H2O、FeSO47H2O、NaCl、KH2PO,瓊脂等Tabl1 Microbes screened from so均為分析純;土樣采自南寧高峰林場(chǎng)肉桂種植林區菌株(S)-(-)-1苯乙醇轉化率/%c/995.1893.23土壤。9.22525二元HPLC泵;2487UV/ⅥS檢測器。17221.2培養基1.2.1平板培養基(g/L)葡萄糖20,蛋白胨由表1可知,有4株菌株可將a苯乙醇中的10,酵母膏2.5,K2HPO41.0,MsoO4TH1。O0.5,(s)、(-)1-苯乙醇選擇性氧化為苯乙酮13'菌株FeSO4·7H2O0.01,NaCl0.5,瓊脂20?？梢垣@得較好的轉化率和ee值,故選13‘菌株作為1.22斜面培養基(gL)KH2PO,3.0,瓊脂25,實(shí)驗菌株。其他試劑與平板培養基相同2.2菌株JX13的鑒定1.2.3富集培養基(g/L)葡萄糖20,蛋白胨l6 S rDNA PCR擴增和序列測定結果表明菌株10,酵母膏2.5,a苯乙醇0.5mL,K2HPO,L.O,了13為草酸桿菌( Oxalobacteraceae),把該菌株命名MgSO4·7H2O0.5,FesO4·7H2O0.01,NaC10.5。為 Oxalobacteraceae sp.鞏X13。1.2.4初始發(fā)酵培養基除不含α-苯乙醇外,其2.3轉化產(chǎn)物的分析鑒定他試劑與富集培養基相同。所有培養基均在120℃標準品和轉化液HPLC液相分析譜圖見(jiàn)圖1滅菌20min。圖13實(shí)驗方法取5g土樣于50mL富集培養基中,30℃培養3d。稀釋涂布分離后,30℃培養3d。挑取單一菌落至斜面培養基上,30℃培養3d保存于4℃冰箱中備用。挑取斜面培養基上的菌種一環(huán),接種于已滅菌裝有100m發(fā)酵培養基的500mL錐形瓶中,30℃、180r/min培養3d加入0.2ga苯乙醇底物,30℃、180r/min轉化3d,得到轉化液。分別以底物中(S)-(-)-1-苯乙醇轉化率和(R)-(+)-1-苯101112131415161718保留時(shí)間/min乙醇的對映體過(guò)量值(e)表示反應的程度和立體圖1標準樣品HPIC圖選擇性。Fig 1 HPLC chromatogram of standard sample1.4分析方法取轉化液1mL于10mL容量瓶中,用流動(dòng)相定容,將定容后樣品轉入干燥離心管中離心8min,取上層清液經(jīng)0.45μm有機系微孔濾膜過(guò)濾后,用HPLC分析。HPLC分析條件:色譜柱為配有相應預柱(0.4cmx1cm)的0.46cmx15cm的 Chiralcel O手性柱( Daicel),流動(dòng)相為v(乙腈):v(水)=1030:70,流速0.5mL/min,紫外檢測波長(cháng)205mm,進(jìn)保留時(shí)間/min樣量10μL。圖2轉化液HPLC圖2結果與討論Fig 2 HPLC chromatogram of sample1.(S)-(-)-苯乙醇;2.(R)-(+)-1-苯乙醇;3.苯乙酮2.1微生物的篩選由圖1、圖2可知,產(chǎn)物的保留時(shí)間與苯乙酮標對土樣進(jìn)行稀釋涂布在平板上長(cháng)出一些菌落,準樣品的保留時(shí)間相同,Ⅸ13菌株有選擇性的氧化經(jīng)平板劃線(xiàn)分離得到38株菌株。對38株菌株進(jìn)行(S)-(-)-1-苯乙醇為苯乙酮,留下未反應的培養和反應,篩選結果見(jiàn)表1。R-(+)-1-苯乙醇,從而實(shí)現消旋苯乙醇的拆分。轉第2李冬桂等:生物法拆分a苯乙41化反應式如下:Oralobacteraceae JX13racemIc-1·PEAR- PEA2.4培養條件對消旋苯乙醇拆分的影響氮源。24.1碳源的影響碳源對微生物的生長(cháng)起著(zhù)重2.5反應條件對消旋苯乙醇拆分的影響要的作用,在無(wú)碳源的發(fā)酵培養基中,分別等質(zhì)量地2.5.1底物加入量影響通常芳香類(lèi)化合物對活添加葡萄糖、乳糖、糊精、麥芽糖、淀粉、蔗糖碳源培性細胞具有一定的毒性,圖5為底物質(zhì)量濃度在養3d后,均加人0.2g/L的a苯乙醇底物反應16g/L時(shí)對a-苯乙醇拆分的影響3d,結果見(jiàn)圖3120轉化率「圈「門(mén)「0麥芽糖糊精葡萄糖蔗糖乳糖淀粉a-苯乙醇質(zhì)量濃度/(g·L圖3碳源種類(lèi)對反應的影響圖5a苯乙醇質(zhì)量濃度對反應的影響Fig 3 Effects of carbon sources on the reactionFig 5 Effect of p(a-PEA)on the reaction由圖3可知,以糊精、麥芽糖為碳源時(shí)。菌體生由圖5可知,底物量在1~3g/L時(shí),底物轉化長(cháng)好,底物的轉化率和ee值都很高;以糊精為碳源率和ee值均達到了100%,當底物加人量為5時(shí),底物的轉化率和ee值達到了100%。因此,選6g/L時(shí),底物轉化率和e值有明顯下降趨勢。因擇糊精作為培養基的適宜碳源此,選取底物加入量為4g/L做其他條件優(yōu)化24.2氦源的影響氮是構成菌體成分和合成蛋2.5.2pH對α-苯乙醇拆分的影響pH的改變會(huì )白質(zhì)和酶等的重要元素氮源主要分為有機氮源和引起酶活性的變化,過(guò)高或過(guò)低的pH會(huì )改變酶活無(wú)機氮源兩類(lèi),當∝苯乙醇為02g/L時(shí),改變初始性中心的構象,造成酶活性的降低。用不同pH的發(fā)酵培養基中的氮源組分,考察等質(zhì)量加入硝酸銨、磷酸鹽緩沖液調節反應體系的pH,考察pH對拆分硫酸銨、蛋白胨、玉米粉、酵母膏氮源對拆分的影響,a苯乙醇的影響結果見(jiàn)圖6。結果見(jiàn)圖4?！蹀D化率6蛋白胨酵母膏硫酸銨硝酸銨玉米粉圖4氮源種類(lèi)對反應的影響圖6pH對反應的影響Fig 6 Efect of pH on the reaction由圖4可知,以蛋白胨和酵母膏為氮源較好,其由圖6可知,pH在5~7時(shí),底物轉化率和e中以蛋白胨為氮源時(shí),底物的轉化率和e值達到值變化不大。因此,13·菌種拆分a苯乙醇適宜的了100%。因此,選擇蛋白胨作為培養基的適宜pH范圍是5~7242應用化工第40卷25.3溫度對α-苯乙醇拆分的影響反應體系的pH=6,30℃反應72h,(S)-(-)-1-苯乙醇轉化率溫度會(huì )影響菌株的催化能力,實(shí)驗考察了20~45℃可達98.63%,ee值達98.01%,實(shí)現了菌株范圍內,反應溫度對拆分反應的影響結果見(jiàn)圖7。 Oxalobacteraceae sp.JK13對a苯乙醇的最佳拆分效參考文獻:R, Paulo J S moraadvances in the biocatalytic asymmetric reduction of ace-tophenones and a, B-unsaturated carbonyl compouds[J]Food Technol Biotechnol, 2004, 42(4): 295-303[2]宮麗,卞俊手性藥物的藥理學(xué)立體選擇性[打]國外醫學(xué)藥學(xué)分冊,2007,34(2):123-126.溫度饣[3]王丹,李亞手性藥物及其開(kāi)發(fā)與應用[J現代醫藥圖7溫度的影響衛生,2007,23(6):837838.Fig 7 Effect of temperature on the reaction[4]王普善王宇梅手性藥物開(kāi)發(fā)戰略的再認識[刀]精由圖7可知,在30℃時(shí),轉化率和ee值為最細與專(zhuān)用化學(xué)品,2004,12(10):48高,隨著(zhù)溫度繼續升高,轉化率和e值均下降,[5]張中義,吳新俠脂肪酶在手性藥物制備中的應l40℃時(shí),基本無(wú)轉化。這主要是因為溫度過(guò)高,部[J].食品與藥品,2007,9:4043.[6]嚴祥輝,薛屏.用殼聚糖修飾的MCM48固定化脂肪分氧化還原酶已失活。因此,選擇30℃為適宜的轉酶拆分(R,S)-1-苯乙醇[J].寧夏大學(xué)學(xué)報,2009,30化溫度。(1):50542.5.4反應進(jìn)程曲線(xiàn)在上述最優(yōu)條件下,考察了[7]王晨王文凱陳華勇脂肪酶催化拆分1(4甲氧基1~5d菌株 Oxalobacteraceae sp.X13拆分α苯乙醇苯基)乙醇的研究[冂]現代食品科技,200,25(4)的反應進(jìn)程,見(jiàn)圖8。[8]王旭徐威游松微生物轉化在藥學(xué)中的應用[門(mén)]沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報2006(23)7:4774829] Nie Y, Xu Y, Mu X Q.of racemic 1-phenyl-1, 2-ethanediol by stereoinmversion in-ing a novel cofactor-dependent oxidoreduction systemof candida parapsilosis CCTCC M203011[J]. 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