玉米秸稈制備燃料乙醇的集成技術(shù)研究

第33卷第5期林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)Vol 33 No 52013年10月Chemistry and Industry of Forest ProductsOct.2013di:10.3969/j.isn.0253-2417.2013.05.004玉米秸稈制備燃料乙醇的集成技術(shù)研究?jì)η锫?楊德良,馬斌,勇強(南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,江蘇南京210037)摘要:175g蒸汽爆破玉米秸稈在底物質(zhì)量濃度100gL,纖維素酶用量20FUg(以纖維素計)、β-葡萄糖苷酶用量3πU/g(以纖維素計)下酶解48h,酶解得率為74.89%;酶解液經(jīng)固液分離,上清液濃縮用于髙糖濃淸液發(fā)酵,葡萄糖利用率為99.56%,乙醇得率為理論得率的94.50%;CHU Oiu-lu474.3g酶解渣經(jīng)釀酒酵母于酵母用量為每克酶解渣2.0×10°個(gè)/克、30℃下固態(tài)發(fā)酵24h再變溫至36℃發(fā)酵42h,反應體系中乙醇質(zhì)量為1.59g。175g蒸汽爆破玉米秸稈經(jīng)低底物濃度水解、高濃清液發(fā)酵、酶解渣固態(tài)變溫發(fā)酵過(guò)程獲得36.49g醇,乙醇轉化率為θ.209g/g(以蒸汽爆破玉米秸稈計)。關(guān)鍵詞:玉米秸稈;酶解渣;固態(tài)變溫發(fā)酵;集成技術(shù)中圖分類(lèi)號:TQ35文獻標識碼:A文章編號:0253-2417(2013)05-0020-05Integrated Process of ethanol production from Corn stoverCHU Qiu-lu, YANG De-liang, MA Bin, YONG QiangCollege of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)Abstract: When the steam exploded corn stover was hydrolyzed by cellulase at substrate loading of 100 g/L and cellulase dosageof 20 FPIU/ g-cellulose, B-glucosidase dosage of 31U/g-cellulose for 48 h, the hydrolysis yield was 74. 89 % Following solidliquid separation, a liquid fermentation of concentrated supernatant was performed, the glucose consumption yield and ethanolyield were 99. 56 and 94. 50 % respectively. Variable temperature fermentation of enzymatic hydrolysis residue was carrieout at yeast loading of 2.0 x 10 cfu/g enzymatic hydrolysis residue, applying 30 C for the first 24 h and 36 C for the next 42 h.It was found that 11. 59 g ethanol was obtained from 474. 3 g enzymatic hydrolysis residue. 175 g steam exploded corn stover wasbio-refinied through the intergrated processes containing lower substrate hydrolysis, higher glucose concentration fermentation andvariable temperature fermentation of enzymatic hydrolysis residue process. Finally, 36. 49 g ethanol was obtained, and thepretreated corn stover-to-ethanol conversion yield was 0. 209 g/gKey words: corn stover; enzymatic hydrolysis residue; two-stage solid state fermentation; integrated process隨著(zhù)全球資源、能源、環(huán)境問(wèn)題的突出和全球氣候變暖趨勢的加強,尋找清潔、可再生能源成為人類(lèi)的必由之路,其中燃料乙醇憑借獨特的優(yōu)勢成為首選之一。植物纖維原料生物法制取乙醇的關(guān)鍵技術(shù)主要包括原料預處理、纖維素酶制備、纖維素水解、糖液發(fā)酵,其中纖維素水解、糖液發(fā)酵技術(shù)是影響乙醇生產(chǎn)成本的關(guān)鍵因素之一。目前研究較多的纖維素水解、糖液發(fā)酵技術(shù)主要包括以下3種:1)低底物濃度纖維素水解、清液乙醇發(fā)酵。該工藝纖維素水解結朿固液分離后有一部分糖殘留于酶解渣中,需耗用大量水洗滌,得到的糖液較稀,需消耗大量的蒸汽進(jìn)行濃縮;如果水解結束固液分離的酶解渣不水洗回收糖則導致糖的損失;2)高底物濃度纖維素水解、帶渣乙醇發(fā)酵,該法存在以下缺點(diǎn):高底物濃度水解產(chǎn)生的終產(chǎn)物抑制作用降低了纖維素酶水解的得率,并且底物濃度受酶水解得率和工業(yè)應用的限制,很難超過(guò)30%;高底物濃度下的酶解、發(fā)酵需要攪拌,能耗高;帶渣發(fā)酵的酵母不能循環(huán)利用;3)纖維素同步糖化發(fā)酵,該工藝存在的缺點(diǎn)是纖維素的酶水解和酵母乙醇發(fā)酵的溫度不一致,影響了纖維收稿日期:2012-10-26基金項目:國際先進(jìn)林業(yè)技術(shù)引進(jìn)項目(2012-4-18);國家自然科學(xué)基金項目(31中國煤化工科研創(chuàng )新計劃(CXZZ1-0527)CNMHG作者簡(jiǎn)介:儲秋露(1986-),女,江蘇宜興人,博士生,主要從事生物質(zhì)資源生物轉化的硎究*通訊作者:勇強,教授,博士生導師,主要從事生物質(zhì)資源生物降解與轉化的研究;E-mail:swhx@njfu,com.cn第5期儲秋露,等:玉米秸稈制備燃料乙醇的集成技術(shù)研究素的酶水解過(guò)程和乙醇發(fā)酵過(guò)程,從而限制了該法在工業(yè)上的應用。綜上所述,從生產(chǎn)成本角度出發(fā),目前研究的主要幾種植物纖維原料纖維素酶水解、糖液發(fā)酵工藝均存在著(zhù)一些問(wèn)題,有待于進(jìn)一步優(yōu)化。本研究探討了玉米秸稈制取燃料乙醇的集成技術(shù),包括低底物濃度酶水解,高糖濃清液發(fā)酵和酶解渣固態(tài)變溫發(fā)酵,可為提高纖維素乙醇生產(chǎn)效率、降低纖維素生物煉制燃料乙醇的成本提供依據。1實(shí)驗1.1菌種釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)NLH3,乙醇發(fā)酵菌株,于4℃保存在葡萄糖瓊脂斜面培養基上,由南京林業(yè)大學(xué)生物化工研究所保存。1.2纖維素酶和B-葡萄糖苷酶纖維素酶購于 Sigma公司濾紙酶活力l02FPUg,B-葡萄糖苷酶活力2.50U/g;β-葡萄糖苷酶,購于 Sigma公司,B-葡萄糖苷酶酶活力504IU/g1.3原料預處理玉*秸稈粉碎至3-5cm,在3.5L蒸汽爆破裝置中于1.5~2.2MPa、停留時(shí)間2-6min下進(jìn)行預處理。預處理后的物料用蒸餾水(總料液比1:10(g:mL))分3次洗滌、抽濾后得到的濾渣,即為蒸汽爆破玉米秸稈。蒸汽爆破玉米秸稈儲存于密封袋中,于4℃冰箱中平衡水分2d,備用。蒸汽爆破玉米秸稈中含水分60.68%,纖維素47.60%(以干基計)。14蒸汽爆破玉米秸稈制備乙醇的集成技術(shù)1.4.1纖維素酶水解175g1.3節蒸汽爆破玉米秸稈于底物質(zhì)量濃度100g/L、纖維素酶用量20FPIU/g(以纖維素為基準,下同)、B-葡萄糖苷酶用量3U/gpH值48、50℃條件下經(jīng)纖維素酶水解48h,水解結束后于4000r/min條件下離心10min,上清液即為玉米秸稈酶水解液,沉淀為酶解渣,備用。平均酶水解反應速率(g/(Lh))和酶解得率(以蒸汽爆破玉米秸稈計)計算如下平均酶水解反應速率=(纖維二糖質(zhì)量濃度+葡萄糖質(zhì)量濃度)/反應時(shí)間酶解得率=(纖維二糖質(zhì)量×0.95+葡萄糖質(zhì)量x0.9)/(175×(1-0.607))×100%1.42高糖濃清液發(fā)酵玉米秸稈酶水解液經(jīng)70℃,0.016MPa減壓蒸發(fā)濃縮至葡萄糖質(zhì)量濃度為180-250g/L后即為高糖濃清液進(jìn)而進(jìn)行發(fā)酵。取50mL高糖液清液于250mL錐形瓶中,加人適量酵母和營(yíng)養鹽(0.08g/ L MgSO4,0.08g/ L ZnCl2,0.20g/ L CaCI2和0.24g/L尿素),于30℃、100r/min條件下發(fā)酵24h。每4h取樣于10000r/min下離心5min,取上清液測定葡萄糖和乙醇濃度。糖利用率和乙醇得率計算如下糖利用率〓發(fā)酵液中消耗葡萄糖質(zhì)量/初始葡萄糖質(zhì)量×100%乙醇得率=發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量/(消耗葡萄糖質(zhì)量×0.51)×100%1.4.3酶解渣固態(tài)變溫發(fā)酵474.3g1.4.1節的酶解渣于500mL圓底燒瓶中,加人適量酵母和營(yíng)養鹽溶液(10g/ L CacI2、4g/ L MgSO4和4g/ L Zncl2),于30℃、100r/min條件下發(fā)酵24h后變溫至36℃再發(fā)酵42h,并取樣于10000r/min下離心5min,取上清液測定葡萄糖和乙醇濃度。發(fā)酵結束后在發(fā)酵醪中加適量蒸餾水,用玻璃棒充分攪拌后于10000y/min下離心5min,取上清液測定葡萄糖和乙醇濃度。酶解、發(fā)酵集成過(guò)程的乙醇轉化率(g/g)計算如下乙醇轉化率=(清液發(fā)酵乙醇質(zhì)量+固態(tài)發(fā)酵乙醇質(zhì)量)蒸汽爆破玉米秸稈質(zhì)量×100%5分析方法5.1原料測定原料中纖維素、戊聚糖和木質(zhì)素等含量的分析均按照美國國家可再生能源實(shí)驗室(NREL)所推薦的方法(。1.5.2纖維素酶活力的測定濾紙酶活力的測定采用國際理論方法測定3。一個(gè)濾紙酶活力單位定義為每分鐘生成1μmdl葡力的測定采用對硝基苯基-B-D-葡萄糖苷(pNPG)試劑方法測定。H中國煤化工推薦的標準CNMHG糖苷酶酶活用循日興酬活力單位定義為每分鐘生成Iμmol對硝基苯酚所需要的酶量。林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)第33卷1.5.3纖維二糖、葡萄糖和乙醇濃度測定采用高效液相色譜( Agilent1200)分析,外標法測定。色譜條件:Bio- Rad Aminex HPX-87H色譜柱(78mm×300mm),進(jìn)樣量10μL;流動(dòng)相0.005moLH2SO4,流速06mL/min,柱溫55℃,示差折光檢測器檢測。2結果與分析802.1蒸汽爆破玉米秸稈制取乙醇集成技術(shù)研究2.1.1蒸汽爆破玉米秸稈的酶水解蒸汽爆破玉米秸稈在底物質(zhì)量濃度100g/L,纖維素酶用量20FPU/gB-葡萄糖苷酶用量3U/g下水解48h其歷程如圖1所示。由圖1可知,經(jīng)過(guò)48h的酶水解,酶解體系中081624324048的葡萄糖質(zhì)量濃度為36.67g/L,酶解得率為時(shí)間h74.89%,平均酶水解反應速率從2h的口-水解速率 hydrolysis rate;-O一酶解得率 hydrolysis yield△一葡萄糖質(zhì)量濃度 glucose concentration6.21g/(Lh)下降至48h的0.82g/(L·h)。酶水解前期的水解速率較高,葡萄糖質(zhì)量濃度快速上圖1蒸汽爆破玉米秸稈的水解歷程Fig. 1 The hydrolysis course of steam exploded corn升,酶水解得率迅速提高。而酶水解后期的水解速stover率較低,葡萄糖質(zhì)量濃度緩慢上升,酶水解得率沒(méi)有明顯的提高,這可能是由于酶在木質(zhì)素上的不可逆非生產(chǎn)性吸附和終產(chǎn)物抑制6造成的。此外,酶水解底物濃度是植物纖維原料制備乙醇的重要因素,低底物濃度下的酶水解得到了較高的酶解得率,為降低植物纖維原料制備燃料乙醇的原料成本提供了依據2.1.2酶解糖液的濃縮蒸汽爆破玉米秸表1濃縮前后糖液中可發(fā)酵性糖和抑制物的濃度稈酶水解液經(jīng)70℃,0.016MPa減壓蒸發(fā)濃Tabe1 The fermentable sugars and inhibitors co縮前后的可發(fā)酵性糖和抑制物的濃度如表1before and after concentration所示。糖液濃縮前濃編后before concentration after concentration由表可知經(jīng)過(guò)濃縮的葡萄糖質(zhì)量濃度葡萄糖ew(gu)35.53216.97達到216.97g/L,木糖質(zhì)量濃度也有所上升。木糖 xylose/(g·L)減壓蒸發(fā)濃縮能有效地脫除抑制物,尤其是甲mag0.320.680.32揮發(fā)性比較大的抑制物,如甲酸、乙酸和糠乙酰丙酸 levulinic acid(g·L)0.030.24醛,其脫除率分別為64.88%、34.40%和羥甲基榛醛/(g:L0.050.2836.25%。揮發(fā)性抑制物的脫除能降低抑制5-hydromethylfuraldehyde糠醛 furfural/(g·0.00.27物對后續己糖發(fā)酵的抑制作用,一定程度上提高濃縮糖液的可發(fā)酵性,提高乙醇產(chǎn)量2.1.3高糖濃清液發(fā)酵高糖濃清液發(fā)酵120歷程見(jiàn)圖2。由圖可知釀酒酵母能夠快速地將葡萄糖轉化為乙醇。由于酵母的加入,發(fā)酵的初始葡萄糖質(zhì)量濃度為19241g/L,發(fā)酵24h后殘余葡萄糖質(zhì)量濃度為0.84g/L,糖利用率為99.56%,乙醇質(zhì)量濃度為92.33g/L,乙醇得率為理論得率的94.50%。48121620239mL清液發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量為24.90g高時(shí)間h糖濃清液發(fā)酵得到了高乙醇質(zhì)量濃度的發(fā)酵質(zhì)量濃度 ass concn:中國煤化工醇ctha液,高乙醇質(zhì)量濃度和高乙醇得率能有效降△-糖利用率goCNMHG低后續乙醇蒸餾的成本和減少纖維素乙醇的圖2高糖濃清液發(fā)髒歷程生產(chǎn)成本。Fig. 2 The fermentation course of concentrated supernatant第5期儲秋露,等:玉米秸稈制備燃料乙醇的集成技術(shù)研究2.1.4酶解渣固態(tài)變溫發(fā)酵歷程釀酒酵母在酵母用量2×10°個(gè)/g(以酶解渣計)下對酶解渣固態(tài)變溫發(fā)酵的歷程如圖3。175g蒸汽爆破玉米秸稈經(jīng)纖維素糖化、固液分離后得到474.3g酶解渣,酶解渣中纖維素含量22.71%,葡萄糖含量12.56g。由圖3可知酶解渣固態(tài)變溫發(fā)酵主要分為2個(gè)階段,發(fā)酵前24h,酶解渣中游離葡萄糖被釀酒酵母快速發(fā)酵成乙醇、少量纖維素被同步糖化發(fā)酵成乙醇。由于反應體系中葡萄糖的存在,此階段纖維素水解受到產(chǎn)物反饋抑制,30℃發(fā)酵24h,體系中葡萄糖質(zhì)量降低到082g酶解渣中纖維素含量從初始的22.71%降低到20.02%,乙醇質(zhì)量和集成過(guò)程乙醇轉化率分別為7.70g和0.186g/g(以蒸汽爆破玉米秸稈計,下同)。酶解渣固態(tài)發(fā)酵24h后,將溫度提高到36℃,隨著(zhù)反應時(shí)間的延長(cháng),盡管體系中葡萄糖質(zhì)量濃度檢測不到,但乙醇質(zhì)量濃度持續增加,原因是酶解渣中殘留的纖維素被吸附在酶解渣上的纖維素酶降解成葡萄糖后迅速被酵母發(fā)酵成乙醇。發(fā)酵66h,體系中乙醇質(zhì)量達到159g,集成過(guò)程的乙醇轉化率達到0.209g′g。第二段36℃發(fā)酵酶解渣中纖維素含量從20.92%下降至12.61%,且纖維素降解速率明顯髙于第一段30℃發(fā)酵纖維素的降解速率。造成上述現象的原因是較高的溫度和體系中葡萄糖對纖維素酶抑制作用的解除促進(jìn)了酶解渣中纖維素的酶水解。對照組為酶解渣在30℃下的恒溫固態(tài)發(fā)酵(見(jiàn)圖3),發(fā)酵66h后,體系中乙醇質(zhì)量為917g,乙醇轉化率為0.195gg,乙醇產(chǎn)量和轉化率均低于固態(tài)變溫發(fā)酵。造成上述現象的原因是酶解渣固態(tài)發(fā)酵具有同步糖化發(fā)酵作用,而同步糖化發(fā)酵中酶最適反應溫度和乙醇發(fā)酵溫度不一致酶反應最適溫度在50℃左右,酵母乙醇發(fā)酵適宜溫度在30℃左右。0.240.22冬爾郵憋紫0.200.180.166t21824是b品0.14612182430364248546066時(shí)間h實(shí)驗組smpi-■一糖 glucose;-▲-乙醇 cthanol,-·-乙醇得率 ethanol yield;-x-纖維素 cellulose對照組 control糖 glucose;-△-乙醇 ethano-o-乙醇得率 ethanol yield圖3酶解潼固態(tài)變溫發(fā)酵歷程Fig 3 The solid state fermentation course of enzymatic hydrolysis residue綜上,在酶解渣固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中,變溫發(fā)酵兼顧了酶解和發(fā)酵對溫度的需求,第一段30℃發(fā)酵有利于游離葡萄糖的發(fā)酵和菌體的生長(cháng)第二段36℃發(fā)酵更有利于酶解渣中纖維素的酶水解,促進(jìn)了乙醇產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。2.2集成技術(shù)的優(yōu)勢玉米秸稈制備燃料乙醇集成技術(shù)中,纖維素在低底物濃度下糖化保證了較高的酶水解得率,高濃度糖液發(fā)酵獲得的高乙醇濃度降低了后續乙醇蒸餾的成本,酶解渣固態(tài)變溫發(fā)酵進(jìn)一步提高了纖維素的轉化率。集成技術(shù)既避免了低底物濃度酶解發(fā)酵分開(kāi)進(jìn)行工藝中酶解渣洗滌耗用大量水和能耗高的問(wèn)題,又避免了高底物濃度酶解水解物直接發(fā)酵工藝中酶水解得率低、能耗高、不能實(shí)現高糖發(fā)酵和酵母回收循環(huán)利用的問(wèn)題同時(shí)酶解渣的固體發(fā)酵具有同步糖化發(fā)酵的作用,進(jìn)一步提高了纖維素的轉化率。中國煤化工3結論CNMHG蒸汽爆破玉米秸稈的集成技術(shù):175g經(jīng)蒸汽爆破后的玉米秸稈,底物質(zhì)量濃度100g/L下纖維素4林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)第33卷酶水解得率為74.89%;含192.41g/L葡萄糖的纖維素水解糖液乙醇發(fā)酵糖利用率為9.56%、乙醇得率為理論得率的94.50%,得到乙醇質(zhì)量為24.90g;474.3g酶解渣經(jīng)釀酒酵母固態(tài)變溫發(fā)酵后,乙醇質(zhì)量為11.59g。175g經(jīng)蒸汽爆破后的玉米秸稈經(jīng)低底物濃度水解、高濃度糖液發(fā)酵和酶解渣固態(tài)變溫發(fā)酵過(guò)程獲得乙醇36.49g,乙醇轉化率為0.209gg(以蒸汽爆破玉米秸稈計)。參考文獻[]董秀芹,呂惠生發(fā)展燃料乙醇產(chǎn)業(yè)是緩解能源危機的重要舉措[].國際學(xué)術(shù)動(dòng)態(tài),2003(3):14-15[2 ]SLUITER A Biomass analysis technology team. laboratory 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