利用聯(lián)合生物工藝生產(chǎn)燃料乙醇的研究進(jìn)展

廣州化工2009年37卷第3期利用聯(lián)合生物工藝生產(chǎn)燃料乙醇的研究進(jìn)展廖禮斌山東化工高級技工學(xué)校,山東滕州27500)摘要:隨著(zhù)生物技術(shù)越來(lái)越多的介入到燃料乙醇的生產(chǎn)中聯(lián)合生物工藝 consolidated biopricessing-CBP因其可將纖維酶生纖維素水解和酒精發(fā)酵融合于一步工藝中完成,更是成為其中的亮點(diǎn)。為使聯(lián)合生物工藝成為可能以?xún)煞N途徑對所需微生物進(jìn)行改造:一種是天然纖維降解微生物改造途徑將天然存在的可降解纖維素的微生物,尤其是厭氧微生物進(jìn)行改造,以使其適應CBP生產(chǎn)的要求;另一種是重組途徑,通過(guò)基因重組的方式將不能降解纖維的微生物獲得降解纖維素的能力,并且生產(chǎn)的產(chǎn)品性質(zhì)符合CBP的要求。兩種途徑的對微生物的改造,無(wú)論從經(jīng)濟性和社會(huì )效益都將為高能耗時(shí)代的今天提供一種低成本的燃料乙醇生產(chǎn)方式。關(guān)鍵詞:纖維素;燃料乙醇聯(lián)合生物工藝重組途徑Research on the Production of Fuel Alcohol by Consolidated BioprocessingLIAO Li-binShandong Chemical School of Senior Technicians, Shandong Tengzhou 277500, China)Abstract: Nowadays, with more and more biotechnology were used in the production of fuel alcohol,(CBP-featuricellulase production, cellulose hydrolysis and fermentation in one step-was becoming one potential approach for its outstandings. In general, consolidated bioprocessing CBP was enveloped through two strategies. One was accompished by reformingthe way of decomposing microbes by natural fibers. In order to meet the demand of the production of CBP, a reforming use wasmade for nature-born microbes especially oxygen-loathing ones. Another was accomplished by reconstructing, which enabledmicrobes can, t decompose fibers to acquire the ability of decomposing as well as to meet the demand of CBP. The above two waysno matter the consideration of economy and social benefits, can both offer us resolutions to produce fuel alcohol with less in-put at present-a time when everything was consumed too muchKey words: cellulose; fuel alcohol; consolidated; recombinant strategy為避免交通給城市帶來(lái)的污染,要求使用無(wú)鉛汽油的呼聲日括生產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)品的步驟底物和原料的消耗相對較低,所以益高漲叫。乙醇作為一種重要的燃料日益引起世界各國的重視尤生產(chǎn)成本低效率高。以使用酶與微生物的協(xié)同作用系統為例那其是將乙醇進(jìn)一步脫水再添加適量汽油后形成變性燃料乙醇。在些以纖維素為食物的并可附著(zhù)在纖維上的微生物在競爭纖維素國外乙醉被視為替代和節約汽油的最佳燃料具有廉價(jià)、清潔環(huán)水解產(chǎn)物方面要比那些不能附著(zhù)的微生物吏具有優(yōu)勢。又由于保安全、可再生等優(yōu)點(diǎn)。作為一種生物能源乙醇有望取代日益些雜菌也不能附著(zhù)在纖維素上,這就增加了微生物分解纖維素減少的化石燃料(如石油和煤炭)。然而,目前汽油主要還是以石工藝的穩定性。在過(guò)去的幾年中已經(jīng)作了大量的工作去降低纖油為原料通過(guò)化學(xué)工藝生產(chǎn),這對于經(jīng)濟的可持續性發(fā)展戰略是維酶生產(chǎn)成本。相對于過(guò)去現在生產(chǎn)L乙醇的纖維酶成本大約不利的。因此世界上許多經(jīng)濟發(fā)達國家都注重以碳水化合物為是10-20美分/加侖是以前成本的十幾分之一。這些進(jìn)展降低原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的生物技術(shù)開(kāi)發(fā)。這其中作為植物生物物質(zhì)了纖維酶的生產(chǎn)成本使以往在工業(yè)規模上無(wú)法實(shí)現的工藝成為的纖維素,由于其來(lái)源廣泛,價(jià)格低廉是最適用于發(fā)酵生產(chǎn)乙可能。但是使用CBP工藝卻可以在此基礎上將成本進(jìn)一步大幅醇的物質(zhì)并且纖維素在轉化過(guò)程中不產(chǎn)生溫室氣體,對環(huán)境無(wú)度降低害。但高昂的成本卻阻礙了這些新技術(shù)的推廣。為此,人們進(jìn)行雖然CBP工藝可以大幅的降低纖維酶的生產(chǎn)成本,但是它了大量的研究簡(jiǎn)化工藝降低成本。其中將纖維素轉化過(guò)程中的對所用的微生物卻有較高的要求。所用的微生物必須比傳統的纖四個(gè)中間轉化過(guò)程(酶解生成葡萄糖將預處理過(guò)的生物物質(zhì)中維發(fā)酵中國煤化工次好的產(chǎn)品構型。因此需的碳水化合物水解為糖,六碳糖發(fā)酵,五碳糖發(fā)酵)在一步工藝要對微中完成的聯(lián)合生物T藝( consolidated bioprocessing)技術(shù)尤為值然纖維CNMHG個(gè)方面進(jìn)行:一種是天天然存在的可降解纖維得注意。CBP相對于其它一體化程度較低的工藝過(guò)程因其不包素的微生物提高其產(chǎn)品的產(chǎn)率和性質(zhì);另一種是重組途徑,是改作者簡(jiǎn)介:廖禮嘁,在職碩士研究生任教于山東化工高媛枝工學(xué)校。200年37卷第3期「州化工造不能分解纖維素的微生物,向其植入纖維酶系統,以使其能分在整個(gè)過(guò)程中其反應性不斷降低)。因此進(jìn)化途徑對擴增異源纖解利用纖維素并表現出較高的產(chǎn)率。以下我們將對這兩種途徑維酶表達系統的理性設計還是有價(jià)值?，F今,纖維酶的異源產(chǎn)品分別進(jìn)行介紹。表達主要應于在釀酒酵母(s, cerevsiae)和以細菌作為宿主(工1天然纖維降解微生物改造途徑程改造奧克西托克雷白桿菌 Klebsiellaoxytoca和可移動(dòng)酵單胞菌2 ymomonas mobilis)的工程改造菌發(fā)酵生產(chǎn)酒精中。在奧克西托將天然存在的可降解纖維素的微生物尤其是厭氧微生物進(jìn)克雷白桿菌( koxytoca)菌株中表達纖維酶可以增加微晶纖維素行改造以使其適應CBP生產(chǎn)的要求。這些研究的主要目的是提的水解率并且可以在使該菌株在無(wú)定型纖維素上厭氧生長(cháng)。雖高纖維降解微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率,以適應工業(yè)化生產(chǎn)的需要。然已有數種葡萄糖降解酶可以在釀酒酵母(s. cerevisae)中表達有文獻報道,對于可分解葉肉的但不能降解纖維的腸道細菌啊進(jìn)但作為該酶的表達結果而使該菌株在纖維上厭氧生長(cháng)卻還未得行的改造收到了較好的效果。這些細菌在混合酸存在條件下的發(fā)到充分證明。最近, kondo和他的同事在不同菌株釀灑酵母(s.酵已經(jīng)可以得到較高的產(chǎn)品收率?？墒钱攽糜诳梢越到饫w維素 cerevsiae)的細胞表面表達了纖維酶、木聚糖酶和淀粉酶在高的細菌時(shí)卻遇到了諸多限制,主要原因在于缺乏合適的基因轉換細胞密度下以重組釀酒酵母( s cerevsiae)菌株無(wú)氧發(fā)酵無(wú)定型技術(shù)。但近期的研究則表明有望突破這些限制。已經(jīng)有對可降解纖維素、粗淀粉和木聚糖,他們每克底物的乙醇收率分別是纖維素的厭氧菌解纖維素梭菌( clostridium cellulolyticum)7]和熱045g、044g和0.3g。已經(jīng)在釀酒酵母( s cerevisiae)中功能性表達纖梭菌( clostridium thermocellum)闕基因轉換研究的報道。在數種纖維二糖水解酶。重組纖維水解酶表現出的活性與天然纖2000年對解纖維素梭菌( C cellulolyticum)和2004年對熱纖梭菌維水解酶相當。因此,增加表達水平是以后研究的重點(diǎn)。( C thermocellum)的研究中描述了這些微生物的電轉化原則,包或許正如預料的那樣,作為異源酶表達的結果,工程改造菌括一些具體的實(shí)驗條件和儀器等。而對于以五碳糖為底物的可降可以在非天然底物上生長(cháng)的能力對以可溶性底物生產(chǎn)乙醇要比解纖維素的嘈熱厭氧菌 Thermoanaerobacterium them用纖維素生產(chǎn)乙醇更加有利。例如,可以將木糖發(fā)酵為乙醇的大arolyticum'和 Thermoanaerbacterium saccharolytium的外源基因腸桿(Ecol),釀酒酵母( scerevisiae)和可移動(dòng)酵單胞菌(Zy-轉換和表達的研究則是對不能發(fā)酵五碳糖的解纖維素梭菌(C. momonas mobilis)在1990年被改造出來(lái)。更近一段時(shí)間,具有thermocellum)基因轉換研究的補充。根據2002的一份研究報告擴大的底物利用能力的數種釀酒酵母( 8. cereis]ae)菌株也被改造顯示叫,對厭氧纖維素分解菌新陳代謝終產(chǎn)物的改造遇到了障出來(lái):一種可以表達木糖異構酶的菌株在木糖上生長(cháng)良好(最大礙。細菌表達丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶增多,導致乳酸鹽減少,比生長(cháng)率Umx=00%h-1)調;一種即可以表達細菌的L阿拉伯醋酸鹽和乙醇增多。而在 T saccharolytic中,由于目標基因被去糖利用基因,又可以過(guò)量表達酵母的半乳糖通透酶基因的菌株也除而使其發(fā)酵產(chǎn)物中不再含有乳酸近來(lái)也實(shí)現了在其產(chǎn)物中去已被改造成功它可以發(fā)酵阿拉伯糖;一種B-葡萄糖酶表達菌除掉乙酸。并且在使用復制質(zhì)粒得試驗中電轉化的高效率已經(jīng)株在纖維二糖上的厭氧生長(cháng)可以達到在葡萄糖上的生長(cháng)水平;可足以去除微生物中的相似目標基因在天然纖維降解微生物改造發(fā)酵支鏈淀粉的釀酒酵母(8 ceresinE)菌株也已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)行前期途徑中微生物對產(chǎn)品的耐受力是影響CBP可行性的關(guān)鍵。最近改造并且在不加淀粉酶的條件下達到較好的產(chǎn)率和產(chǎn)品濃度的研究已經(jīng)實(shí)現了耐乙醇嗜熱菌株的篩選和改造凹。所篩選的菌株可以在乙醇濃度超過(guò)6的環(huán)境下生長(cháng),而這個(gè)濃度已經(jīng)足3影響CBP可行性的因素夠使嗜熱菌擺脫在以木質(zhì)纖維素發(fā)酵乙醇的生產(chǎn)中所處的不利最近關(guān)于解纖維素梭菌( C thermocellum)利用纖維素的一位置。但同時(shí)也有報道顯示解纖維素梭菌( C thermocellum)及其項研究為CBP的可行性提供了實(shí)驗證據。實(shí)驗顯示解纖維素他嗜熱菌發(fā)酵纖維素生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量被限制于26g/以下。因此,梭菌( C thermocellum)水解的纖維素產(chǎn)物的聚合度相當于4個(gè)我們認為要解決天然纖維降解微生物的乙醇耐受性與最大生產(chǎn)葡萄糖單位。因此,它的纖維素水解機理不同于真菌的纖維酶系濃度之間的矛盾可以通過(guò)代謝工程嘬大化乙醇產(chǎn)率來(lái)解決。統一其水解產(chǎn)物主要為纖維二糖。生理研究和以14C標記的纖維2重組途徑素試驗都顯示,生長(cháng)于纖維素上的微生物的生物能量效益取決于胞內低聚糖攝取過(guò)程中β-糖背鍵磷酸解的效率,并且這些效益不能降解纖維的微生物要想獲得降解纖維素的能力,并且生超過(guò)了纖維素合成的生物能量成本。這項工作也解釋了為什么天產(chǎn)的產(chǎn)品性質(zhì)符合CBP的要求,可以通過(guò)基因重組的方式。這種生可降解纖維素的微生物能在纖維素上快速生長(cháng)(例如在微品途徑主要是通過(guò)改造異源纖維酶系統使微生物能在預處理過(guò)的纖維素上Umax0.16h-1),盡管厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的ATP并不多。木質(zhì)纖維素上生長(cháng)發(fā)酵。如果促使生長(cháng)的異源酶量表達的足夠酶一微生物協(xié)同進(jìn)一步增大了CBP的潛在可行性和效果多便可以用達到一定生長(cháng)率所需要的具體酶量作為測定酶活得相比于酶微生物復合體,當使用纖維素一酶微生物復合體依據。有文獻報道如果促使生長(cháng)的纖維酶的比活力達到特定的水時(shí)由于纖維酶的水解效率得到提高這種可能性也會(huì )得到提高。平那么生長(cháng)所需要的表達量也應符合要求調。已有關(guān)于釀酒酵纖維素池物的纖維素水解中占據母( saccharomyces cerevisia)w和大腸桿菌(Ecoi)嗎在這個(gè)水中心位中國煤化工的專(zhuān)一性纖維素水解酶平的蛋白質(zhì)表達報道但迄今為止還無(wú)活性纖維酶表達的相關(guān)報卻僅僅CNMHG不包括可天然降解纖維素的活細胞?；氐?956年纖維酶的先驅Reee和 Mandels觀(guān)察重組途徑的CBP改造可得到模型的支持。這個(gè)模型結合了到酶制備物即使在優(yōu)化的條件下其水解率也大大低于培養中的生物發(fā)酵的能量因素和底物水解動(dòng)力學(xué)(底物預先處理并且纖維降解微生物。因此定量評價(jià)酶微生物系統是未來(lái)重要的研廣州化工2009年37卷第3期究課題,也可為CBP提供進(jìn)一步的證據支持[10] Mai V, Lorenz WW, Wiegel J: Transformation of Thermanacrobacteriumsp strain JW/L-YS485 with plasmid plKMI conferring kanamycin re-sistance. FEMS Microbiol Lett 1997, 148: 163-167.CBP可以成為以酶或者微生物催化水解纖維素類(lèi)物質(zhì)轉變[ Guerdon E. Desvaux M, Petitdemange H: Improvement o cellulolytic為酒精及其他產(chǎn)物的最廉價(jià)的工藝路線(xiàn)。因此,為進(jìn)一步改進(jìn)這roperties of Clostridium cellulolyticum by metabolic engineering Appl種低成本酒精生產(chǎn)工藝有必要繼續利用上文提到的兩種途徑對Environ microbiol 2002. 68: 53-58.纖維素降解微生物進(jìn)行改造以使這些微生物具有較高的酒精產(chǎn)12 Strobel HE, Lymn B: Proteomic analysis of ethanol sensitivitiy in Clostrid-um thermocellum. In proceeding of the National Meeting of the Ameri-率和較高的酒精耐受性。并且在這方面的成功將可以為利用纖can Society of Microbiology May 23-27th 2004. New Orleans, LA. Ab-維素低成本生產(chǎn)燃料乙醇技術(shù)帶來(lái)一個(gè)長(cháng)足的進(jìn)步,從而帶來(lái)可stract number 0-094觀(guān)的經(jīng)濟和社會(huì )效益。[13]謝麗萍王正祥諸葛使利用可再生資源生產(chǎn)酒精的細菌酵母中的代謝工程[J]食品與發(fā)酵工業(yè)27(1263-68參考文獻[14] Park EH, Shin YM. 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