乙醇對腸黏膜屏障功能的影響及作用機制

山西醫藥雜志2012年7月幕41卷A Shanxi Med J. July 2012. vol 41. No. 7 the Second667著(zhù)乙醇對腸黏膜屏障功能的影響及作用機制中國醫科大學(xué)附屬第一醫院(11000)終靜王穎王炳元【摘要】目的探討乙醇對腸上皮細胞屏障功能的影響及作用機制。方法將不同濃度的乙醇與腸上皮細胞株Caco2細胞共培養4h,采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法及乳酸脫氫酶法(LDH)檢測細胞存活率。應用Caco2細胞建立腸上皮細胞屏障模型,不同濃度乙醇溶液處理后,測定其跨上皮細胞電阻值(TEER)及熒光黃透過(guò)率的變化。應用蛋白印跡法及免疫熒光染色法檢測緊密連接蛋白 occludin的表達和分布。結果乙醇濃度≤5%時(shí),不影響Caco2細胞的生存率。乙醇誘導腸上皮細胞屏障通透性增加,呈濃度時(shí)間依賴(lài)性;乙醇作用后,細胞膜上 occludin表達逐漸降低,60min時(shí)達最低值,細胞膜上呈點(diǎn)狀分布,此后部分可逐漸恢復,趨勢與TEER值及熒光黃透過(guò)率一致。結論乙醇可破壞細胞間緊密連接蛋白,進(jìn)而誘導腸上皮細胞屏障通透性增加【關(guān)鍵詞】乙醇;跨上皮細胞電阻;緊密連接;Caco2細胞目前研究中關(guān)于乙醇致腸道通透性改變的病理培養箱中培養24b后換上含不同濃度乙醇的培養液(1%機制很多,均認為腸道通透性改變的根本原因在于25%5%7.5%、10%),每種濃度設6孔重復,以不含乙腸道黏膜的損傷。完整的腸黏膜是防止細菌移位醇的培養液為陰性對照,分組繼續培養4h后,每孔加人的基礎及主要屏障。實(shí)驗發(fā)現在給予添加乙醇飲MTT20μ(5g/L),溫浴4b,棄上清液,每孔加入DM食的大鼠中有腸道上皮細胞緊密連接的破壞,提0150L,室溫避光播床上充分振蕩10mi,混勻后以空示在乙醇誘導的腸道通透性改變中,腸黏膜上皮屏白孔調零,在酶標儀上檢測490mm波長(cháng)吸光度(A)值障遭到的破壞是可能的機制之一。每次實(shí)驗重復3次。1.2.3乳酸脫氫酶(LDH)檢測法:本實(shí)驗采用LDH試劑材料和方法盒檢測Caco2細胞經(jīng)不同乙醇濃度(1%、2.5%、5%1.1材料7.5%10%)作用4h后,細胞溶質(zhì)中LDH的釋放進(jìn)面評Caco2細胞株購自南京凱基生物有限公司,達氏修正估細胞的生存率依氏培養基(DMEM)高糖培養液及胎牛血清購自美國Hy1.2.4腸上皮細胞屏障通透性的檢測:Caco2細胞形成單clone公司,四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國 Sigma公層上皮細胞屏障后,在 Transwell 2基底側加入不同濃度的乙甲基亞砜(DMSO)購自北京索萊寶科學(xué)技術(shù)有限公司醇(1%2.5%5%),孵育不同時(shí)間(0、15、30、60、120、180occludin抗體購自北京博奧森公司、美國 Santa Cruz公司240min),觀(guān)察加人乙醇前后Caco2細胞TEER的變化情熒光黃購自美國 Sigma公司況,并測定加入乙醇后Caco2細胞對熒光黃透過(guò)率的改1.2方法變。每種實(shí)驗均選取4組非同代細胞進(jìn)行。①TEER的測1.2.1體外腸上皮細胞屏障模型的建立:分化良好的Caco2細胞接種于 Trans-well板上(孔徑3pm,有效膜面積定:應用細胞電阻儀(EVOM)測定加入乙醇前后Caco2細胞的TEER測定方法參照文獻[1],為保證數值的準確1.12cm2),接種密度為1×105/cm2,隔天換液( Transwell上層加入600L培養液下層加入1800μL培養液),倒置性,整個(gè)過(guò)程在恒定溫度下(37℃)進(jìn)行,每個(gè) Transwell均顯微鏡下觀(guān)察細胞生長(cháng)情況,同時(shí)測定跨上皮細胞電阻取不同方向的3個(gè)點(diǎn)重復測定3次。②熒光黃透過(guò)率的(TEER)。約21~24d細胞形成緊密單層TEER明顯升檢測:應用熒光黃作為標記物檢測乙醇對Caco2細胞細高,證明腸上皮細胞屏障形成胞旁轉運的影響。細胞用Hank平衡鹽溶液(HBSs)(pH1.22MTT比色實(shí)驗:將處于對數生長(cháng)期的細胞,用7.4)小心沖洗3次,37℃孵育30min,吸凈孔內的HBSS以25%胰蛋白酶消化后以每孔1×10加入96孔培養板防止干擾;在 Transwell頂端加入408/mL熒光黃,37℃中,每孔體積10,置于37℃,體積分數為5%C02的朝育1b后收集基底側液體,熒光分光度計下測定吸光度(激發(fā)波長(cháng)427nm,發(fā)射波長(cháng)536nm),根據標準曲線(xiàn)計算熒光黃濃度基金項目:遼寧省科技廳高等學(xué)?？蒲许椖?2009A809)1.2.5蛋白印跡法檢測緊密連接相關(guān)蛋白表達:當Tran通信作者;王炳元,Email:wangby@medmail.com.cnswell小室的上室細胞生長(cháng)至融合時(shí),用含有0.1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)不含鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液山西醫藥雜志2012年7月第41卷第7期下半月 Shanxi Med J,July2012,Vol.41,No.7 the second(PBS)沖洗,細胞鏟小心刮取細胞,倒人1mL裂解液A(2測結果提示(檢測時(shí)間4h),當乙醇濃度≤5%時(shí),Caco2細mmo/ L EDTA,10mmol/L乙二醇雙醚四乙酸(EGTA),胞處理組生長(cháng)抑制率與對照組相比差異無(wú)統計學(xué)意義(P>0.4%NaF,20mmol/ L Tis-Hcl,蛋白酶抑制劑混合物,苯0.05);當乙醇濃度>5%時(shí),細胞生長(cháng)抑制率隨乙醇處理濃甲基磺酰氟(PMSF),1% Titon x100,pH7.5),4℃勻度升高而顯著(zhù)升高,與對照組比較差異有統計學(xué)意義(P<漿,離心,上清液為蛋白樣品液。加入抗 occludin抗體(1:0.05或P<0,01)。LDH試劑盒檢測結果提示(檢測時(shí)間4100),抗β肌動(dòng)蛋白抗體(1:5000,4℃孵育過(guò)夜,在羊h),當乙醇濃度≤10%時(shí),Caco2細胞處理組生長(cháng)抑制率與抗兔辣根過(guò)氧化物標記的IgG二抗中37℃孵育45min,化對照組相比差異無(wú)統計學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1學(xué)發(fā)光(ECL),X線(xiàn)片曝光、顯像,所得膠片用 Chemi Ima表1各組MTT比色法及LDH法檢測ger5500V3.0軟件掃描,通過(guò) Fluor Chen2.0軟件進(jìn)行定細胞生存率(%)(x±s)量分析,測得A值組別醇MTT比色法LDH法1.2.6免疫熒光觀(guān)察緊密連接相關(guān)蛋白 occludin的表達照組00.0±1.0100.0±1,1和分布:依照不同的實(shí)驗組,將生長(cháng)在蓋玻片上Caco2單1%乙醇組99.9士0.499.1±1.02.5%乙醇組9.9±0.9100.4±3.5層用4%的多聚甲醛固定30min,用0.5% Triton X-100透5%乙醇組99.5±4.299.2±1.9化5min,用5%牛血清白蛋白(BsA)封閉1h?？贵w稀釋7.5%乙醇組73.6±5.201,0士4.3度: occludin(1:60),陰性對照用0.01mol/LPBS代替一10%乙醇組48.3土3.498.6±士5.1抗,4℃孵育過(guò)夜。應用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的熒2.2乙醇對Cac2細胞的屏障功能的作用:為了確定乙光二抗(1:100)孵育1h,避光操作甘油封片,熒光顯微鏡醇在不破壞Caco2細胞膜的情況下是否對細胞的屏障功觀(guān)察,采集圖像。能有直接的損傷作用,本實(shí)驗觀(guān)察了乙醇對培養的Caco21.3統計學(xué)處理細胞緊密連接的作用。測定不同濃度乙醇對腸上皮細胞屏所有數據以王士s表示,2組間采用t檢驗,多組間比較障作用不同時(shí)間的TEER變化,見(jiàn)表2。檢測不同濃度乙采用重復測量的方差分析和 Bonferroni檢驗,P<0.05為醇作用不同時(shí)間的熒光黃透過(guò)率的變化,見(jiàn)表3,發(fā)現腸上差異有統計學(xué)意義皮屏障通透性增加,呈時(shí)間濃度依賴(lài)性,作用60min時(shí)2結果TEER值達最低值,熒光黃透過(guò)率達峰值,此后可逐漸恢2.1乙醇對Caco2細胞的生長(cháng)抑制作用:MTT比色法檢復2各組不同時(shí)間腸上皮細胞屏障通透性(TEER值)(x士s)n/cm215n1%乙醇組387.0±3.9372.7±3.4357.6±2.9348.7士4.0350.8士4.3361.2±4,8374,8±5.22.5%乙醇組3.9士4.8362.9士2.9348.13.3327.6士3.4346.5士5.23578士46372.7士4.45%乙醇組383.6士4.7348.9士2.9334.3±3.6311.9士5.6335.8±4.26.0±3.9370.2±4.4表3各組不同時(shí)間腸上皮細胞屏障通透性(熒光黃透過(guò)率)(%)(x±s)組別15 min30 min60 min20 min180 min240 min1%乙醇組0.99±0.258.00士1.0512.15±0.5214.50±0.3775士0.3710.75±0.328.50±0.472.5%乙醇組0.99±0.258.60士0.4914.20±0.3916.80±0.3614.30±0.4012.20±0.338.90士0.485%乙醇組0.99士0.259.00士0.3417.00士0.3719.80士0.4318.80士0.5114.90士0.369.30±0.282.3乙醇作用后腸上皮細胞間緊密連接蛋白 occludin表蛋白的重分布:免疫熒光分析顯示,在未處理的細胞中,oc達水平顯著(zhù)減低:通過(guò)前期研究,選擇不影響Caco2細胞 cludin位于細胞膜上,且呈連續性分布。乙醇處理60min生存率且明顯增加腸上皮細胞屏障通透性為原則故選擇時(shí), occludin在細胞膜上表達水平降低,由細胞膜向細胞質(zhì)5%乙醇為作用濃度進(jìn)行以下實(shí)驗。結果顯示,5%乙醇作內轉移,部分斷裂消失。乙醇處理180min時(shí),可見(jiàn)細胞膜用過(guò)程中, occludin表達水平逐漸降低,60min時(shí)達最低值,上 occludin蛋白表達部分恢復。此后逐漸恢復.60min組 occludin 3白表達水平與其他各3討論組相比差異具有統計學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1腸黏膜上皮屏障是構成機體內外環(huán)境之間的preludin一種機械保護作用的組織學(xué)屏障,在防止病原微生物從黏膜侵入方面有著(zhù)非常重要的作用。腸黏膜12345678上皮屏障主要由兩部分組成,腸黏膜上皮細胞及其1:對照組;2:0min組;3:30min組;4:60min組;5:120min組;6:180min組;7:210min組;8:300min組周?chē)木o密連接。緊密連接由相鄰細胞膜處各種圖1蛋白印跡法檢測各組 occludin蛋白的表達蛋白質(zhì)的相互作用所構成2,其中 occludin是最主2.4乙醇誘導腸上皮細胞屏障緊密連接相關(guān)蛋白 occludin要的跨膜蛋白。正常情況下,緊密連接通過(guò)調控作山西醫藥雜志2012年7月第41喜第7期下半月 Shanxi Med J,July2012.vol.41,No.7 the second·669用,選擇性地轉運相應物質(zhì)而有效地阻止腸腔內峰值,此后逐漸恢復。通過(guò)蛋白印跡法及免疫熒光細菌、毒素及炎癥介質(zhì)等物質(zhì)的旁細胞轉運維持染色法檢測細胞間緊密連接蛋白 occludin表達水腸黏膜上皮屏障功能的完整平與TEER值及熒光黃透過(guò)率趨勢一致。FishSwanson等和Rao3報道乙醇可致腸上皮er證明了緊密連接與TEER直接相關(guān),更加支持屏障功能障礙,使小腸黏膜通透性增加。然而,腸我們的結論:乙醇可通過(guò)破壞Cac2細胞緊密連上皮屏障功能的改變是由于乙醇直接損傷腸黏膜接的完整性進(jìn)而增加腸上皮屏障通透性。細胞引起的還是損傷細胞間緊密連接所致有待進(jìn)綜上所述,乙醇濃度≤5%時(shí)可短暫性破壞細步詳細闡明。本實(shí)驗首先通過(guò)MTT比色法及胞間緊密連接,導致腸黏膜屏障通透性增加;當5%檢測LDH來(lái)評價(jià)乙醇對Caco2細胞生存率的影<乙醇濃度≤10%時(shí),可使腸上皮細胞發(fā)生脫落,響。MTT可被活細胞線(xiàn)粒體上琥珀酸脫氫酶轉化可能與細胞間緊密連接破壞程度較嚴重有關(guān)。上成藍紫色甲臢顆粒此顆粒被DMS溶解后用分光述具體機制很復雜,有待于進(jìn)一步研究。光度計測定出A值,A值的大小與活細胞數呈正參考文獻相關(guān)。我們在MTT實(shí)驗中發(fā)現,乙醇濃度在不1] Schmitz H, Fromm M,Bnal,eta. Tumor necrosis fac-超過(guò)5%時(shí),與對照組相比細胞生存率影響差異無(wú)tor-alpha(TNF alpha) regulates the epithelial barrier in the統計學(xué)意義(P>0.05),如超過(guò)5%時(shí),細胞首先human intestinal cell line HT-29/B6. J Cell Sci. 1991.12(P發(fā)生脫落,影響細胞生存率的檢測結果。而LDH[2] Anderson JM, van Itallie CM. Tight junctions and the mol試驗是用紫外分光光度儀測定乳酸鹽的含量。因lar basis for regulation of paracellular permeability. Am J僅使用培養細胞的廢液來(lái)進(jìn)行,故不受細胞脫落、Physiol,1995,269:467-475漂浮等因素的影響。我們在LDH實(shí)驗發(fā)現,乙醇[3]鄒仲之,組織學(xué)與胚胎學(xué),6版北京:人民衛生出版社,2005:15-18濃度不超過(guò)10%與對照組相比細胞生存率影響差[4 Swanson G, Forsyth CB, Tang Y, et al. Role of intestinal ci異無(wú)統計學(xué)意義(P>0.05)。證實(shí)乙醇濃度≤5%dian genes in aleohohinduced gut leakiness, Alcohol Clin Exp時(shí)不影響細胞生存率;5%<乙醇濃度≤10%時(shí)Res2011,35(7);1305-1314Caco2細胞發(fā)生脫落而細胞未出現破裂而導致細5] Rao r. Endotoxemia and gut barrier dysfunction in alcoholic胞死亡,可能與細胞間緊密連接蛋白損傷嚴重程度liver disease. Hepatology, 2009, 50(2): 638-644較大有關(guān)。[6]成惠林,劉承基檢測細胞活性的MTT方法江蘇醫藥,1996,22(5):330-33通過(guò)前期試驗乙醇濃度選擇5%,進(jìn)行后續實(shí)(7]Ftrs. Swaan PW, Eddington nd,el. The ethanol驗,檢測體外腸上皮屏障通透性。本實(shí)驗中通過(guò)tabolite acetaldehyde increases para-cellular drug permeabilityTEER及熒光黃透過(guò)率來(lái)檢測腸上皮屏障通透性in vitro and oral bioavailability in vioo. J Pharmacol Exp TherTEER是檢測細胞屏障的指標,其值越大代表細2010,332(1):326333胞的屏障功能越好。而熒光黃透過(guò)率實(shí)驗檢測腸(收稿日期:20120406)上皮屏障通透性,較TEER實(shí)驗更準確,不易受外作者簡(jiǎn)介:俸靜,女,1979年11月生,主治醫師,中國醫科大學(xué)附禹第一醫院,110001界因素影響。本實(shí)驗發(fā)現乙醇作用后,腸上皮屏障通透性增加,呈時(shí)間濃度依賴(lài)性,作用60mn時(shí)達