乙二醇/絲素蛋白共混膜的研究

Journal of Silk第50卷No23213年09月第09期研究與技術(shù)o:10.3969/j.issn.1001-7003.2013.09.001乙二醇/絲素蛋白共混膜的研究錢(qián)巧芬,張珊珊,侯靜,吳琪,盧神州(1.蘇州大學(xué)紡織與服裝工程學(xué)院,江蘇蘇州215123;南通蘇州大學(xué)紡織研究院,江蘇蘇州215123)摘要:將絲素蛋白水溶液和乙二醇混合,制備透明絲素蛋白共混膜。用X射線(xiàn)衍射、紅外光譜法對共混膜的結構進(jìn)行分析,并測定其溶失率、學(xué)性能及透光率,考察了其酶降解性能。在透明膜上培養L929細胞并對其黏附率和增殖進(jìn)行測定,察其生物相容性。研究表明:乙二醇能誘導絲素蛋白由無(wú)規結構向 Silk結晶結構轉變,并且共混膜的溶失率得到了極大的改善,透光性良好。當乙二醇質(zhì)量分數為30%時(shí),共混膜柔韌性最好。試驗表明,透明絲素蛋白膜具有較好的生物降解性,能夠很好地支持角膜成纖維細胞在其上的黏附與增殖,細胞相容性良好。關(guān)鍵詞:絲素蛋白;透明;乙二醇;膜中圖分類(lèi)號:TB383文獻標志碼:A文章編號:1001-7003(2013)09-0001-06 Study on Ethylene Glycol/Silk Fibroin Blend Membrane (1. College of Textile and Clothing Engineering, Soochow University, Suzhou 215123, China; 2. Nantong Textile Institute of Soochow University, Suzhou 215123, China) Abstract: This study blends aqueous solution of silk fibroin and ethylene glycol and prepares transparent silk fibroin blend membrane; analyzes the structure of the blend membrane with X-ray diffraction and infrared spectroscopy nd investigates its enzymatic degradation property; cultures L929 cell on the transparent membrane, measures its adhesion rate and proliferation and investigates its hat ethylene glycol can induce silk fibroin to transform from disordered structure into Silk crystal ne has been greatly improved; it has a good light-admitting quality. When the mass fraction of ethylene glycol is 30%, the blend membrane has the best flexibility. The test shows that transparent silk fibroin membrane has a good biodegradability and cytocompatibility and can well support the adhesion and proliferation of fibroblast on it Key words: silk fibroin; transparent; ethylene glycol; membrane幾個(gè)世紀以來(lái),蠶絲作為一種紡織材料,因其特級和納米級的絲素纖維、絲素膜、絲素水凝膠、多孔殊的光澤和良好的機械性能而廣為人知。蠶絲能材料、球狀骨針、膠囊等3一般認為,絲素蛋白除被溴化鋰硫氰酸鋰硫氰酸鈣、氯化鈣等的濃溶液了無(wú)規卷曲結構,還存在 Silk和SilkⅡ兩種結晶結溶解(21,從而加工成其他形態(tài)的材料,如直徑為微米構。研究表明,濕熱法、有機溶劑法和拉伸處理法能夠促使絲素蛋白從無(wú)規卷曲向B-折疊結構轉變4,收稿日期:201303-11最終使得絲素蛋白材料不溶于水。得益于其良好的基金項目:國家自然基金(1203107):南通市科技計劃項目生物相容性,很多種類(lèi)的細胞能在絲素膜上生長(cháng)(BK2012095)教育部留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)基金資助項目人角膜內皮細胞可以在絲素膜上生長(cháng),表明絲素膜(K510212作者簡(jiǎn)介:錢(qián)巧芬(1989),女,碩士研究生,研究方向為可以用于角膜移植人角膜成纖維細胞在絲素膜絲素蛋白材料。通信作者:盧神州,副教授 lushenzhou@及絲素多孔材料上培養結果表明,絲素蛋白材料對 suda.edu.cno角膜組織的修復有重大的利用價(jià)值。但是絲素溶1第50 Journal of Silk液直接澆鑄在基質(zhì)上,待液體揮發(fā)并最終轉變?yōu)楣?.3溶失率測定相,得到的絲素膜脆性較大,強度不夠,且易溶于將共混膜在恒溫恒濕(25℃,相對濕度65%)下水,使其應用于角膜的修復受到限制。因此,如何平衡24h,每個(gè)稱(chēng)取質(zhì)量W1(g)的樣品3塊然后在改善絲素蛋白膜的水溶性及透明性,使其更加符合烘箱中105℃烘至恒重。稱(chēng)重得到W2(g)。含水率人角膜移植的要求是目前角膜組織修復的一個(gè)熱C的計算公式:點(diǎn)。目前有些文獻采用絲素蛋白與其他化合物或天C/%=1-W2×100(1)然高聚物共混合來(lái)改善其水溶性及生物相容性。W絲素蛋白溶液與山梨醇或肌醇共混,可以制備出不將共混膜在恒溫恒濕(25℃,相對濕度65%)環(huán)溶于水的透明絲素膜101,但是兩種共混膜只能在干境中平衡24h,然后準確稱(chēng)取0.1g左右的樣品W1,態(tài)下保持較好的透光率,在濕態(tài)時(shí)透光率不理想,使放入錐形瓶中,按浴比1:100加入去離子水,37℃水其在角膜修復工程上的應用受到了限制。因此,需浴預熱30min后在37℃的水浴恒溫震蕩器中震蕩24h,然后取出溶液。用 Smartspec型紫外分光光度要尋求一種醇類(lèi)化合物,在將其與絲素蛋白混合后,計測出溶液在278nm下的吸光度A。共混膜的絲素共混膜在干、濕態(tài)都能保持良好的透光率。蛋白溶失率D計算公式:將一定比例的聚乙二醇混入絲素膜可使膜在保持原有良好生物性質(zhì)前提下改善膜的柔韌性,且透D/%xv(1-C)W×100(2)光性較好,但因其聚合物相對分子量較大,故與絲素式中:K為絲素溶液的紫外吸光常數,K=1.1026的可混性稍差。因此,本文考慮采用相對分子量剩下的絲素膜固體用去離子水沖洗3遍后放入較小的乙二醇,與絲素共混的方法制得絲素蛋白透105℃烘箱中烘干得W2。共混膜的質(zhì)量溶失率Z計明共混膜,對其結構和性能進(jìn)行了研究,并在其上培算公式:養L929細胞,研究其生物相容性。%(1-C)×W1-W2100(3) (1-C)1試驗與方法1.4力學(xué)性能測試1.1絲素蛋白共混膜的制備使用美國 Instron3365型萬(wàn)能材料試驗機進(jìn)行測家蠶生絲置于質(zhì)量分數為0.05%的Na2CO3溶試,拉伸速度為20mm/min,夾距為28mm,試樣是按照GB/T10402006標準工字3型刀具壓出的樣條。液中,于98~100℃處理30min,重復3次,脫去生絲測試干態(tài)強力前將樣條在恒溫恒濕(25℃,相對濕度中的絲膠。洗凈干燥后的純絲素纖維在65℃下溶解65%)中平衡24h;濕態(tài)強力測試則是將樣品于生理于9.3mol/L的溴化鋰溶液中,透析3d后過(guò)濾得到鹽水中浸泡24h后,取出擦干測定。純絲素溶液。1.5透光率測定取40mL絲素溶液,按乙二醇/絲素質(zhì)量分數分將共混膜平鋪置于24孔板板底,用酶標儀別為0:10、1:10、:10、3:10、:105:06:10比(BIO-EK SYNERGY)分別測定492、550mm及例向絲素溶液中加入相應質(zhì)量的乙二醇,混合均勻70nm處的吸光度值(A)。千態(tài)透光率直接鋪板測后倒入聚苯乙烯塑料模具中,在室溫下于通風(fēng)櫥中定。測試濕態(tài)下的透光率時(shí),先將膜在去離子水中風(fēng)干即得共混膜。浸泡24h,再將其平鋪于培養板底,加入1mL去離1.2結構表征子水進(jìn)行測試。不同波長(cháng)下各檢測4個(gè)孔,取平均使用全自動(dòng) X'PERT PRO MPD射線(xiàn)衍射儀(荷值。透光率T計算公式:蘭帕納科公司),CuKa射線(xiàn),在管電壓40kV、管電T/%=10-×100(4)流35mA、掃描速度10°min的條件下,記錄得到1.6降解性2=5°~45°的衍射強度曲線(xiàn)。用 Nicolet5700f-i選取質(zhì)量分數為30%的乙二醇共混膜分別用型傅立葉變換紅外光譜儀測試,將共混膜加工成直tris緩沖溶液和蛋白酶-XⅣ溶液降解,對照樣為用徑小于80μm的粉末后,KBr壓片制樣,測試4000~體積分數75%乙醇浸泡2h的純絲素膜。將兩種材400cm吸光度得到共混膜的紅外吸收光譜。料于去離子水中浸泡72h后取出,干燥后稱(chēng)取降解2 Journal of Silk綢男50年0第09期樣品0.1g置入離心管中,按浴比1:100分別向其中懸液,兩種材料各重復6孔,置于CO2培養箱中培加入10mL的tris緩沖溶液,2/mL的蛋白酶XⅣ養,隔天換液。分別于1、3、5、7、9d,每孔加入溶液,放置于37℃的水浴恒溫震蕩器中降解,每?jì)商?0μL摩爾濃度為50mol/L的樹(shù)脂天青溶液,并于換液一次。分別于第1、3、6、9、12、15d取出樣品,每培養箱中孵育6h;在酶標儀上測定其熒光強度個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復3次,用去離子水充分洗滌后干燥并(flU值,激發(fā)波長(cháng)530nm,發(fā)射波長(cháng)590mm)(12稱(chēng)重,計算出失重率,將第3d的樣品制成粉末用于測定細胞增殖率。X射線(xiàn)衍射。1.7細胞相容性2結果與分析將含乙二醇質(zhì)量分數為30%的絲素溶液直接2.1絲素蛋白膜的結構加入24孔板風(fēng)干成膜,對照樣為經(jīng)體積分數75%乙二醇/絲素共混膜的X衍射曲線(xiàn)和紅外光譜乙醇處理過(guò)的純絲素膜。取處于對數生長(cháng)期的圖分別如圖1(a)和圖1(b)所示。由圖1(a)中可以L(fǎng)929細胞,胰酶消化后用完全培養基制成細胞懸看出純絲素膜主要以無(wú)定形結構為主,曲線(xiàn)b~g均液,調整細胞濃度為1×103個(gè)/mL,每孔加入mL在12.2°、19.7°、24.7°、28.2°、32.3°、36.8°處有衍細胞懸液,兩種材料各重復4孔,置于CO2培養箱射峰出現,這說(shuō)明乙二醇主要是誘導絲素蛋白由無(wú)中培養。分別于接種后1、3、5h計數未黏附的細胞規結構向 Silk結晶結構轉變;另外當乙二醇/絲素數,計算細胞的黏附率。取處于對數生長(cháng)期的L929質(zhì)量比為5/10、6/10(圖中的f,g)時(shí),20在9.1°出細胞,胰酶消化后用完全培養基制成細胞懸液,調現了silkⅡ的衍射峰,說(shuō)明隨著(zhù)乙二醇濃度的升高,整細胞濃度為2×104個(gè)/mL,每孔加入200μL細胞逐漸形成SilkⅡ型結晶結構。1653.81629.312421541.9買(mǎi)線(xiàn)01020304030405018001600140012001000800600衍射角)(a)X衍射曲線(xiàn)波數cm(b)紅外光譜圖曲線(xiàn)ag中,m乙醇絲素0:10,1:102:103:10:10,5:10,6:10圖1絲素蛋白共混膜的結構 Fig. 1 Structure of blend silk fibroin membranes由圖1(b)可以看出,純絲素膜的紅外吸收峰在膜的吸收峰位置相近,由于在紅外譜圖上難以區分1651.5cm-1(酰胺I),1542cm-(酰胺Ⅱ,a螺旋與無(wú)規卷曲,結合前面的X射線(xiàn)衍射結果,可1244cm(酰胺Ⅱ),屬于無(wú)規卷曲結構3。乙二以得出這3種比例的乙二醇/絲素共混膜中的絲素醇/絲素質(zhì)量比為1/10、2/10、3/10(圖中的b,c,d)時(shí),蛋白均為α螺旋構象。當乙二醇/絲素質(zhì)量比為共混膜中的絲素蛋白在酰胺I酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ區的吸4/10、5/10(圖中的,f)時(shí),共混膜在酰胺I酰胺Ⅱ收峰均在1653.8、1541.9、1242cm附近,與純絲素區的吸收峰變寬;繼續增加乙二醇的濃度,共混膜逐3第50卷 Vol.013年0月綢 Journal of Silkno.09sep2013漸在1629cm-處出現新的吸收峰,1653.8cm處醇/絲素質(zhì)量比為6/10時(shí),質(zhì)量損失率約為20%,故的吸收峰也逐漸變弱,這說(shuō)明,當乙二醇/絲素質(zhì)量可知共混膜中的乙二醇還有部分未溶出。比超過(guò)4/10時(shí),共混膜中的a螺旋構象逐漸減少,B100100折疊構象逐漸增多。8070由此可知,當乙二醇濃度較低時(shí),其主要促進(jìn)絲606050素蛋白由無(wú)規結構向 Silk結晶結構轉變,而當乙二40水系檻40醇/絲素為6/10時(shí),有部分絲素蛋白向SilkⅡ結晶結3020構轉變。003.2溶失率102030405060102030405060乙二醇質(zhì)量分數%乙二醇質(zhì)量分數%乙二醇/絲素共混膜的熱水溶失率如圖2所示。(a)絲素蛋白溶失率(b)絲素膜質(zhì)量損失率在圖2(a)中可以看出,乙二醇質(zhì)量分數為10%時(shí),圖2絲素蛋白膜的溶失率共混膜的絲素蛋白溶失率就從純絲素膜的90%降至 Fig. Dissolve-loss rate of silk fibroin membranes5%以下,繼續增加乙二醇的含量,絲素蛋白的溶失3.3力學(xué)性能率幾乎不變。因此可知,當加入的乙二醇的質(zhì)量占乙二醇/絲素共混膜在干態(tài)和濕態(tài)下的力學(xué)性絲素蛋白質(zhì)量的10%時(shí),絲素膜就開(kāi)始不溶,可以能如圖3所示。在干態(tài)下,共混膜的強度隨著(zhù)乙二通過(guò)將乙二醇與絲素蛋白共混解決絲素蛋白的水溶醇含量的增加而下降,應變則隨著(zhù)乙二醇含量的增性問(wèn)題。加先增大后減小,這說(shuō)明乙二醇對絲素蛋白起到增在圖2(b)中,乙二醇質(zhì)量分數為10%時(shí),共混塑作用。同時(shí)可以看出,當乙二醇質(zhì)量分數為30%膜中的乙二醇幾乎全部溶出,隨著(zhù)乙二醇濃度的升時(shí),共混膜柔韌性最好,所以可以通過(guò)調控乙二醇的高,共混膜的質(zhì)量損失率呈緩慢上升趨勢,當乙二質(zhì)量分數來(lái)制備出所需的力學(xué)性能的絲素蛋白膜。60斷裂強度114012斷裂強度200-斷裂伸長(cháng)率12-斷裂伸長(cháng)率1801600014004000證120606100海藍業(yè)02.00008642iozo3o4o《so《6《020304050《0乙二醇質(zhì)量分數%乙二醇質(zhì)量分數%(a)干態(tài)力學(xué)性能(b)濕態(tài)力學(xué)性能圖3絲素蛋白膜的力學(xué)性能 Fig. 3 Mechanical property of silk fibroin membranes從圖3(b)中可以看出,在濕態(tài)下,共混膜的強度混膜在450500、700m波長(cháng)下的透光率如圖4所示。隨著(zhù)乙二醇質(zhì)量分數的增大而下降,伸長(cháng)率變化的由圖4(a)可以看出,在干態(tài)下,共混膜的透光率極好,規律也是如此。均在90%以上,且乙二醇含量的增加對干態(tài)透光率影3.4透光性響不大。由圖4(b)可以看出,與千態(tài)相比,共混膜濕人眼角膜的透光率隨著(zhù)波長(cháng)的增加而上升,在態(tài)透光率略有下降但仍有著(zhù)較高的透光率,且其透光450nm處約為80%,在500mm處接近90%,700m率均在90%以上由此可見(jiàn),乙二醇絲素蛋白共混膜以上時(shí)透光率趨于穩定約為95%141干、濕態(tài)下的共透光率接近人的角膜,可望用于人的眼角膜修復材料。 Vol.50No.09.sep.2013 Journal of Silk第50卷2013年09月第09期95c95b90a8585102030405060102030405060質(zhì)量分數/質(zhì)量分數%(a)態(tài)透光率(b)濕態(tài)透光a.492nm;b.550nm;c.700nm圖4透明絲素蛋白膜的透光性 Fig.4 Light transmission of transparent silk fibroin membranes3.6體外降解100乙二醇/絲素共混膜在蛋白酶XV溶液中的降解情況如圖5所示。純絲素膜和乙二醇/絲素共混80膜在tris緩沖溶液中幾乎不降解。從圖5(c)可以看口純絲素膜6030%乙二醇絲素出,純絲素膜在蛋白酶溶液中,質(zhì)量分數呈線(xiàn)性下降,在第15d的時(shí)候,質(zhì)量分數下降至50%左右共40混絲素膜則在降解第1d的時(shí)候,質(zhì)量分數就下降至35%左右,在第3d時(shí),下降至13%左右,最后在第206d時(shí)幾乎全部降解,質(zhì)量分數還剩6%左右,之后質(zhì)量分數變化不明顯?？梢?jiàn)蛋白酶XV對 Silk結構的絲素膜降解作用較強。培養時(shí)間/h100:圖6L929細胞在透明絲素膜上的黏附率0 Fig.6 Cell attachment of L929 cells on transparent silk fibroin70 membranes50用倒置相差顯微鏡觀(guān)察細胞的生長(cháng)形態(tài),如圖740所示。從圖7可以看出,第1d時(shí),細胞數目較少,不3020同材料間沒(méi)有明顯差異;第3d時(shí),細胞數目明顯增10d多,說(shuō)明兩種材料增殖均較好,純絲素膜和共混膜上00123456789101112131415降解時(shí)間d的細胞形態(tài)較好,細胞呈梭形、三角形以及多邊形,a.純絲素膜在tris緩沖溶液的降解;b.30%的乙二醇/絲素共混膜分散也較均勻;培養第5d時(shí),兩種材料上的細胞均在tis緩沖溶液中的降解;c.純絲素膜在蛋白膜溶液中的降解;鋪滿(mǎn)整個(gè)視野,并開(kāi)始有圓縮細胞產(chǎn)生,細胞數目沒(méi)d.30%乙二醇/絲素共混膜在蛋白膜溶液中的降解有明顯差異?？傮w看來(lái),共混膜上的細胞不僅形態(tài)圖5絲素膜在降解過(guò)程中的質(zhì)量分數變化 Fig. 5 Weight changes of silk fibroin membranes during絲素 enzymatic degradation3.7細胞相容性L(fǎng)929細胞在兩種絲素膜上的黏附率如圖6所示。從圖6可以得知,細胞在共混絲素膜上的黏附乙二醇絲素率較好,在1h后就達到了80%以上,并隨著(zhù)時(shí)間的 ld 3d 5d增加繼續增加。通過(guò)SPSS軟件分析,乙二醇共混膜圖7L929細胞在不同材料上培養不同天數的生長(cháng)形態(tài)與純絲素膜的細胞黏附率無(wú)顯著(zhù)性差異,但要優(yōu)于Fig.7 Phase contrast light microscope images of929cel純絲素膜。 cultured different days on different silk fibroin membranes5第52013年綢 Joumnal of Silkc0e01良好,且能夠很好地分散在膜上各處,說(shuō)明共混膜能 silk proteins Progress in Polymer Science2 2039夠很好地支持細胞的生長(cháng)。1093-1115lU值的大小反應了活細胞的數量,如圖8所4]Vhux, WANG,eta. l Water-insoluble silk films示。從圖8可以看出,L929細胞在共混膜上的增殖 with silk I structure [J]. Acta Biomaterialia, 2010,6(4)::1380-1387較好,在第5d和第7d時(shí),略好于純絲素膜。經(jīng)統計[UNGER, WOLF PETERS, et al Growth of分析可知,兩者沒(méi)有顯著(zhù)性差異。 human cells on a non-woven silk fibroin net: a potential for14000純絲素膜 use in tissue engineering[j]. Biomaterials,2004,25(6):1200030%乙二醇/絲素1069-1075.10000 [6]MADDEN P W, LAI N X, GEORGE A, et al. Human8000 corneal endothelial cell growth on a silk fibroin membrane6000] Biomaterials,20132(1):407640844000 [7] LA WRENCE B D, MARC RCHANT J K, PINDRUS M A, et al2000 Silk film biomaterials for comea tissue engineering [J]. Biomaterials,2009,30(7):1299-130805 [8] KWEON H, HA H C, UM I C, et al. Physical properties of培養天數d silk fibroin/chitosan blend films J]. Journal of Applied圖8L929細胞在不同材料上培養不同天數的FLU值 Polymer Science, 2001, 80(7) 928-934. Fig.8 Fluorescence value of L929 cells cultured different days [9 SHE Z, ZHANG, JIN C, et al. Preparation and in vitro on different silk fibroin membranes degradation of porous three-dimensional silk fibroin/chitosan由上可知,共混膜在黏附率和細胞增殖上與純 scaffold. Polymer Degradation and Stability,2089絲素膜均沒(méi)有顯著(zhù)性差異,但又略?xún)?yōu)于純絲素膜。(7):1316-1322另外,共混膜在乙二醇質(zhì)量分數為10%時(shí)即不溶于10]羅敏清,張岑岑,毛麗,等水不溶性透明絲素蛋白膜的制備及性能[J].高分子材料科學(xué)與工程,2011,27(8):水,且柔軟性明顯優(yōu)于純絲素膜,在生物材料上的應141-145用更加廣泛。 LUO Minqing, ZHANG Cencen, MAO Li, et al. Preparation of transparent water-insoluble silk fibroin films [J]. Polymer4結論 Materials Science and Engineering, 2011,27(8) 141-145.11]劉宇清,于偉東,孫東豪聚乙二醇一絲素共混膜物理性1)乙二醇/絲素共混膜的絲素溶失率小于2%,能的研究[]東華大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2003,29(6):具有較高的強度與較好的斷裂伸長(cháng)率,在干濕態(tài)下100-103.的透光率都超過(guò)90%,滿(mǎn)足角膜修復材料的要求。 LIU Yuqing, YU Weidong, SUN Donghao. Study on2)乙二醇/絲素共混膜的主要結晶結構為SilkI physical properties of poly ethylene glyeol -silk fibroin在tris緩沖溶液中幾乎不降解,在蛋白酶中降解性 polyblend membranes J]. Journal of Donghua University: Natural Science Edition, 2003, 29(6): 100-103.較好。 [12]ANOOPKUMAR-DUKIE S, CAREY J B, CONERE T, et3)乙二醇/絲素共混膜,能夠很好地支持成纖維 al. Resazurin assay of radiation response in cultured cells細胞在其上的黏附與增殖,細胞相容性良好。 [] The British Institute of Radiology, 2005, 78 (934):945-947.參考文獻:[3] WEI, HUANG,mal,etal. Structure regulation] VEPARI C, KAPLAN D L. Silk as a biomaterial[ J]. Progress of silk fibroin films for controlled drug release[J]. Journal in Polymer Science, 2007,32(8) 991-1007. of Applied Poly ymer cience,2012,125(s2):ea77-e484 [2]WENK E, MERKLE H P, MEINEL L. Silk fibroin as a [14]VAN DEN BERG T, TAN K. Light transmittance of the vehicle for drug delivery applications]. Joumal of human cormea from 320 to 700 nm for different ages J] Controlled Release, 2011, 150(2): 128-141. Vision Research, 1994,34 11) 1453-1456 [3]HARDY J G, SCHEIBEL TR. Composite materials based on6