聚乙二醇衍生物修飾胰蛋白酶的研究

第29卷第3期南京師大學(xué)報(自然科學(xué)版)Vol. 29 No. 32006年9月JOURNAL OF NANJING NORMAL UNIV ERSITY( Natural Science )Sep 2006聚乙二醇衍生物修飾胰蛋白酶的研究董偉吳進(jìn)劉紅楊生濤王偉偉(南京理工大學(xué)化工學(xué)院江蘇南京210094 )[摘要]采用各種類(lèi)型的聚乙二醇衍生物修飾胰蛋白酶對所修飾酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了評價(jià)并與原酶比較.結果表明修飾酶的殘存活力受修飾劑的結構、分子量和修飾化度的影響較大其中分子量為5000或6000的2種聚乙二醇衍生物所修飾的酶活力升高.所有修飾酶的熱穩定性顯著(zhù)改善其最適pH值沒(méi)有發(fā)生變化修飾酶的Km值有所增加.實(shí)驗表明采用合適的修飾劑對胰蛋白酶進(jìn)行適度地修飾不會(huì )降低酶的活性和改變酶性能.[關(guān)鍵詞]聚乙二醇衍生物胰蛋白酶化學(xué)修飾. [中圖分類(lèi)號]Q814 [文獻標識碼]A [文章編號]1001-4616( 2006 )03-0053-05Studies on the Modification of Trypsin with Polyethylene Glycol DerivativesDong Wei , Wu Jin , Liu Hong , Yang Shengtao , Wang Weiwei( School of Chemical Engineering , Nanjing University of Science and Technology , Nanjing 210094 , China )Abstract :Trypsin was modified by a series of PEG derivatives , then the properties of modified enzymeswere evaluated and were compared with native enzyme. The results show that the activity of modified en-zymes depended on the structure ,molecular weight of PEG derivatives and the degreed of modification ,and the activity of enzyme modified by PEG derivatives( M = 5000 or 6000 ) was enhanced. The thermalstability of all modified enzymes was improved significantly. The modification does not change the opti-mum pH value of trypsin. The Km values of the conjugates are slightly higher than the native enzyme. Thtemperate modification did not reduce enzyme' s activity.Key words PEG derivatives , trypsin , chemical modification化學(xué)修飾作為提高多肽、核酸和多糖等生物分子的臨床和生物學(xué)性能的重要手段得到日益廣泛的研究和應用.化學(xué)修飾的效果好壞很大程度上取決于化學(xué)修飾劑的性能優(yōu)劣.在眾多的化學(xué)修飾劑中聚乙二醇Polyethyleneglycol,PEG)及其衍生物由于具有線(xiàn)性、無(wú)毒、無(wú)免疫原性以及良好的生物相容性等優(yōu)良性能而在化學(xué)修飾中應用最廣泛聚乙二醇對蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾已被證明具有頗多優(yōu)點(diǎn)通過(guò)對蛋白質(zhì)實(shí)施PEG化降低了其免疫原性和體內清除的速率延長(cháng)了其在體內的半衰期增加了蛋白質(zhì)的溶解性和熱力學(xué)穩定性以及抗蛋白酶降解的能力(21.胰蛋白酶(Trypsin)以蛋白酶原的形式存在于動(dòng)物胰臟中,-般從牛、羊和豬胰臟中提取,它能夠催化水解堿性氨基酸的羧基所形成的肽鍵、酰胺鍵和酯鍵.國外的科研工作者關(guān)于胰蛋白酶的化學(xué)修飾已經(jīng)做了不少研究.Elsner等人用小分子物質(zhì)修飾胰蛋白酶實(shí)現胰蛋白酶的胍基化和琥珀?；疾旎瘜W(xué)修飾對酶催化行為和穩定性的影響,Gaertner 等人41使用氰尿酰氯活化的單甲氧基聚乙二醇( mPEG ,CH3O-PEG-OH)和對硝基苯酚氯甲酸酯活化的mPEG(mPEG-NPC)作為修飾劑并對修飾酶進(jìn)行了表征;Zalipsky等人S1使用PEG - ss(聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯)和PEG - CS(羧甲基化聚乙二醇琥珀酰亞胺酯)修飾胰蛋白酶,比較了兩種修飾劑的優(yōu)劣.本研究工作是采用分子量為2000-10000的4種不同類(lèi)型的PEG修飾劑來(lái)修飾胰蛋白酶,詳細探討各種修飾劑對中國煤化工響并測定修飾酶的YHCNMH G收稿日期:006.04-17.7基金項目:江蘇省高校高新技術(shù)發(fā)展資助項目(JHB04-037).作者簡(jiǎn)介:董偉,1964-副教授主要從事蛋白質(zhì)化學(xué)修飾和陽(yáng)離子聚合物基因傳遞系統的教學(xué)與研究.E-mail : dvmailcn@ yahoo. com. cn一53一南京師大學(xué)報(自然科學(xué)版)第29卷第3期(2006年)修飾化度、酶活、熱穩定性、pH穩定性和K,(米氏常數)值研究胰蛋白酶的酶學(xué)性能變化進(jìn)而評價(jià)所合成的各種修飾劑.1材料和方法1.1 材料單甲氧基聚乙二醇( mPEG )N-羥基琥珀酰亞胺( NHS )L-賴(lài)氨酸、2 4 6-三硝基苯磺酸鈉( TN-BS)N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽( BAEE )均購于美國Sigma公司;PEG4000 ,PEG60(化學(xué)純)購于廣州化學(xué)試劑經(jīng)營(yíng)批發(fā)部進(jìn)口分裝);N N-二環(huán)己基碳二亞胺( DCC )購于東京化成工業(yè)株式會(huì )社胰蛋白酶購于美國Invitrogen公司考馬斯亮藍G250購于Fluka公司牛血清白蛋白( BSA )購于上?；瘜W(xué)試劑公司其它試劑均為國產(chǎn)市售分析純試劑.1.2 聚乙二醇衍生物的合成按文獻方法分別合成了PEG - SA , mPEG - SA(61 ,mPEG - CA[7]和BmPEC814種類(lèi)型的聚乙二醇衍生物各種類(lèi)型衍生物結構式如圖1.PEC -SA:mPEG- -SA:0H0OC-CH2CH2-C-0-PEG-0-C-CH2CH2-C00HmPEC- -0-C-CH,CH- COOHBnPEG:mPEG-CA:mPEG-OCH2CONHmPFC- -0CH2C00H(CH2).HC-C00HmPEG-OCH.CONH圖1 各種類(lèi)型PEG衍生物結構式為了使所合成的PEG衍生物能夠在較溫和的條件下直接修飾蛋白質(zhì)或酶避免修飾過(guò)程中蛋白質(zhì)的高級結構的破壞和活性喪失需進(jìn)行活化使其與NHS和DCC反應形成琥珀酰亞胺活性酯.這樣上述PEG -SA ,mPEG - SA mPEG - CA和BmPEG就轉變成相應類(lèi)型的蛋白質(zhì)修飾劑PEG - ss. mPEG - Ss. mPEG -CS和BmPEG - Lys - NHS.以mPEG - CA轉變?yōu)閙PEG - CS為例來(lái)說(shuō)明末端羧基活化的過(guò)程如下:mPEG0CH.COOH ~NHS> mPEGOCH,C-O-N'DCCmPEG- CAmPEG-CS1.3 胰蛋白酶的化學(xué)修飾.稱(chēng)取一定量的胰蛋白酶(5mg)溶于5mLpH9.3硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液中配制酶濃度為1mg/mL加入一定量活化聚乙二醇修飾劑在常溫下( 20-25 C )磁力攪拌反應4 h.所加入的修飾劑量與胰蛋白酶分子中可被修飾的氨基量成-定的摩爾比.為了使修飾反應能夠充分進(jìn)行,反應中PEG修飾劑用量充分過(guò)量, PEG修飾劑: NH2 =5:1(摩爾比)胰蛋白酶中可被修飾的氨基為15個(gè),即PEG修飾劑: Tryp-sin=75: 1.1.4修飾酶的純化采用透析法進(jìn)行蛋白質(zhì)純化透析液為pH=8.2 Tris- HCl緩沖液透析在4 C下進(jìn)行.透析袋規格為D36 mm、截留分子量8 000 - 14 000.1.5 修飾酶的蛋白質(zhì)濃度的測定采用Bradford 檢測法°]測定蛋白質(zhì)濃度.中國煤化工1.6 胰蛋白酶修飾化度測定MHCNMHG采用三硝基苯磺酸鈉(TNBS)法來(lái)測定胰蛋白酶修飾化度10].取1.0mL0.01%(W/V)TNBS水溶液至1.5mLTris-HCI(pH8.2)緩沖溶液中混合均勻后作為參比;另取兩只試管分別加入1.0mLTNBS水溶液隨后依次加入1. 5 mL胰蛋白酶和修飾酶(蛋白濃度均為0. 25 mg/mL)混合均勻后室溫下靜置30一.54董偉等聚乙二醇衍生物修飾胰蛋白酶的研究min后在420 nm處測定吸光度值.1.7 胰蛋白酶酶活性測定11]為簡(jiǎn)單起見(jiàn),本文只測定其相對酶活的變化,即比活力的變化.測定胰蛋白酶酶活時(shí)采用的底物為N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽( BAEE );用0. 10 mol/L pH=8.0 Tris- HCI緩沖液(內含10 mmol/LCa2+ )配制0. 5 mmol/L BAEE底物溶液.1.8胰蛋 白酶及修飾酶的熱穩定性的測定選擇了兩個(gè)溫度( 37 C 60 C )來(lái)衡量酶修飾前后熱穩定性的變化具體操作方法如下確定原酶與修飾酶的濃度均為0.5mg/mL將其放入相應溫度的恒溫箱中每隔一定時(shí)間取出酶液室溫下測定其酶活力最后將測得的各個(gè)時(shí)段的酶活與各自修飾酶恒溫前的初始酶活相比較計算出經(jīng)過(guò)不同時(shí)間后的酶活力殘存百分比,從而可以比較熱穩定性的變化.1.9pH值對胰蛋白酶及修飾酶活性的影響選取不同pH值( 5. 0、6.0、7.0、8.0、9. 0.9.5和10 )的底物溶液并配制1 mg/mL的酶溶液測出在上述不同pH值條件下的酶活力,以最適pH值條件下的酶活力為100%,計算出該酶在其余pH值下活性殘留百分比觀(guān)察酶活性隨pH值的變化趨勢并比較原酶與修飾酶的最適pH值變化情況.1.10胰蛋白酶及修飾酶Km值的測定米氏常數Km值的測定采用雙倒數作圖法( Lineweaver-Burk法y121.2結果與討論2.1酶的活性殘存 與修飾化度關(guān)系在相同摩爾比的反應條件下不同類(lèi)型修飾劑修飾胰蛋白酶所得到的修飾化度是不同的酶的殘存活力也不相同.修飾酶的活力和修飾化度的關(guān)系如圖2所示.值得強調的是，當親電的PEG修飾劑和親核的氨基發(fā)生取代反應時(shí)胰蛋白酶分子中游離的氨基都有可能被修飾,此過(guò)程屬于隨機修飾測得的修飾化度為平均修飾化度.從圖2中可以看出胰蛋白酶被同-種類(lèi)型的修飾劑修飾后其修飾化度隨著(zhù)修飾劑分子量的增加而降低,例如:PEG4000-ss-Trypsin修飾化度為51.0%而PEG6000-ss-Trypsin修飾化度則為24.4% .修飾化度對修飾酶活力影響較大.選擇合適的修飾劑、進(jìn)行適度的修飾,可以使胰蛋白酶的活力升高過(guò)度修飾會(huì )降低酶的活性.圖中結果顯示PEG6000-ss-Trypsin和mPEG5000-ss-Trypsin的酶活力比原酶的活力高而其它修飾酶的酶活力比原酶低.分析原因適度的修飾不但不會(huì )影響底物與酶活性中心的結合反而因其對酶構象的穩定并使酶對外部環(huán)境的適應性增強使酶的活性有所提高但也有可能是因為修飾使其具有更活潑更易催化的構型.修飾化度愈大修飾劑在胰蛋白酶分子表面形成的屏障愈突出對底物與活性位點(diǎn)結合的阻礙作用愈大使得酶的活性有所降低.120[口Relaive activitySSSS Degree of modifcation00望8(i 60出4020中國煤化工ABDIFYHCNMHG日2 胰蛋自酶及其修飾酶的活力、修飾化度關(guān)系A. Native Trypsin B. PEG4000- ss -Trypsin C. PEG6000 SS-Trypsin D. mPEG2000-SS -Trypsin E. mPEC5000 SS-TrypsinE. mPEG2000- CS-Trypsin G. mPEC5000- CS -Trypsin H . 2mPE2000-Lys-Trypsin I .2mPEGS00-Lyst -Trypsin-55一南京師大學(xué)報(自然科學(xué)版)第29卷第3期(2006年)2.2胰蛋 白酶熱穩定性變化考察了原酶與8種修飾酶的熱穩定性變化-- Native Trypsin .趨勢.從實(shí)驗數據看經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾以后胰蛋白10→- PEG6000 SS-Trypsin酶的熱穩定性有了顯著(zhù)提高.但不同類(lèi)型的修飾-4- mPEC5000-SS -Trypsin劑對胰蛋白酶熱穩定性的改善程度是不一樣的;-▼mPEG5000-CS- -Trypsin而同一類(lèi)型不同分子量的PEG所修飾的胰蛋白◆2mPEC2000-Ly-Trypsin50 t酶的熱穩定性沒(méi)有太大的差別.為清晰可見(jiàn)每種類(lèi)型修飾劑選擇1個(gè)將其在37 °C熱穩定性變◆化趨勢繪于圖3中.從圖中可以看出熱穩定性的順序如下:20下=XBmPEG> mPEG - CS> mPEG -SS> PEG .-SS>原酶胰蛋白酶及其修飾酶在60C下的熱穩定性變03405060Time/h化規律也是一致的.放置0.5h后活力殘留數圖337C下胰蛋白酶及其修飾酶的熱穩定性據見(jiàn)表1.胰蛋白酶偶聯(lián)PEG鏈后維持了蛋白質(zhì)的天然構表160C下原酶 與修飾酶熱穩定性數據象增強了蛋白質(zhì)的剛性從而改善了胰蛋白酶的熱穩定性.Relative activity/%2.3 pH值對酶活性的影響Enzymeafter 30 min at 60 C具體的各酶在不同pH值下活力變化情況見(jiàn)圖4.從圖~ Native Typsin中可以看出胰蛋白酶經(jīng)過(guò)聚乙二醇衍生物修飾后其酶的PEC400 -Ss -Typsin4.6最適pH值并沒(méi)有發(fā)生變化其最適pH值保持在pH =PEG6000 - ss - Trypsin7. 5mPEG2000 -Ss - Trypsin12. 38.0在這一pH值下不管是原酶還是修飾酶都具有最好的mPEG5000 - ss - Trypsin11.7催化活性.在pH值小于8.0的溶液中原酶與修飾酶的活mPEC2000 - cS - Trypsin14. 5力變化趨勢幾乎一樣修飾酶并沒(méi)有表現出比原酶更好的mPEG5000 - CS - Trypsin18.52mPEG2000 - Lys - Trypsin .37. 9耐酸性;但是在pH值大于8.0時(shí)修飾酶活力下降趨勢比_2mPEG5000 - Lys - Trypsin19.7原酶要慢,體現出較好的耐堿性.2.4胰蛋白酶修飾前后 Km值的變化依照雙倒數作圖法求出胰蛋白酶及其修飾100酶的Km值其數值見(jiàn)表2.80表2胰蛋白酶及修飾酶的Km值Km/( mmo/L) .--. Narive TrypsinTrypsin .0. 023-●-PEG6000-SS-TrypsinPEC4000 - ss - Trypsin0. 032-▲ - -mPEG5000-SS Trypsin0. 044mPEG2000 - ss - Trypsin0. 03720-▼V- - mPEC5000-CS-Trypsin0.039◆2mPEG2000-Lys-TrypsinmPEG2000 - CS - Trypsin0.028mPEG5000 - Cs - Typsin0. 0342mPEC2000 - Lys - TrypsinpH2mPEG5000 - Lys - Trypsin0.063圍4不同 pH值條件下胰蛋白酶及修飾酶活力殘存百分數從表2中可以看出胰蛋白酶經(jīng)各種修飾劑修飾以后其米氏常數K.值均有不同程度的增加這可近:似表明修飾酶對底物的親和力較原酶小由于聚乙二醇與蛋白質(zhì)相偶聯(lián)在蛋白質(zhì)分子的表面形成---個(gè)柔性的屏障在-定程度上阻礙了底物與活性中心的結合,即酶對底物的親和力降低;但是在蛋白質(zhì)分子表面偶聯(lián).上PEG分子，又增加了蛋白質(zhì)表面的親水性從而酶中國煤化工是高.因此可以發(fā)現與原酶的K值相比,雖然修飾酶的Km值增加,但幅度并不是YHCNMHG的應用.在修飾酶中,2mPEG5000 - Lys - Trypsin的Km值最大這可能與它的結構和分子量有關(guān).這種酶是分枝型的聚乙二醇所修飾的,它比線(xiàn)性修飾劑所形成的屏障更大;并且其分子量也最大所具有的鏈更長(cháng),因此對底物與活性位點(diǎn)結合的阻礙更大.- 56董偉等聚乙二醇衍生物修飾胰蛋白酶的研究3結論采用各種類(lèi)型的聚乙二醇衍生物修飾胰蛋白酶.從修飾的結果可以看出修飾酶的殘存活力受多種因素影響其中修飾劑的結構、分子量及酶的修飾化度對修飾酶的殘存活力影響顯著(zhù),但各種修飾酶的熱穩定性顯著(zhù)改善這主要取決于修飾劑的結構與其分子量的大小關(guān)系不大;其最適pH值并沒(méi)有發(fā)生變化;由于偶聯(lián)PEG修飾酶的Km值有所增加.通過(guò)對修飾酶的酶學(xué)性質(zhì)的表征,比較得出分枝型修飾劑2mPEG和mPEG-CS修飾蛋白質(zhì)性能優(yōu)于可降解的PEG-ss和mPEG-Ss.[參考文獻][ 1 ] Koumenis I L , Shahrokh Z. 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