改進(jìn)的柳枝稷預處理方法及乙醇發(fā)酵研究

第30卷第12期太陽(yáng)能學(xué)報Vol 30. No 12200年12月ACTA ENERGIAE SOLARIS SINICA文章編號:02540096200)12170904改進(jìn)的柳枝稷預處理方法及乙醇發(fā)酵研究段仰凱,田沈,于泳,周桂雄,楊秀山(首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京100048)摘要:為了提高柳枝稷中纖維素和半纖維素糖的轉化率降低水解液中抑制劑的濃度,首先,用稀酸在溫和條件下對柳枝稷進(jìn)行水解然后用堿對酸水解后的固體物進(jìn)行預處理,接著(zhù)用纖維素酶酶解并分別對稀酸水解液和酶解液進(jìn)行乙醇發(fā)酵。結果表明纖維素轉化率達到9426%,半纖維素轉化率為60.93%,稀酸水解液乙醇發(fā)酵的乙醇產(chǎn)率為04416乙醇/g糖,達到最高理論值的8647%。酶解液乙醇發(fā)酵的乙醇產(chǎn)率為0.486g乙醇g葡萄糖,達到最高理論值的9529%。關(guān)鍵詞:柳枝稷;溫和條件;酸水解:纖維素和半纖維素轉化率;乙醇;發(fā)酵;抑制劑中圖分類(lèi)號:TK16文獻標識碼:A0引言1.1.1原料柳枝稷樣品由北京市農業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究中心纖維素燃料乙醇等可再生能源的開(kāi)發(fā)已引起世提供,樣品含纖維素30.0%,半纖維素25.5%,其它界各國的普遍關(guān)注12。能源草是纖維素乙醇生產(chǎn)45.5%。粉碎,過(guò)40目篩,備用。中的重要原料草本植物柳枝稷的優(yōu)勢尤為突出。1.1.2纖維素酶與傳統植物相比,柳枝稷的抗旱能力強、需肥量少Celluclast1L(諾維信公司),酶活為≥7000g;蟲(chóng)害少、產(chǎn)量高其作為CA植物對氮和水的利用率纖維二糖酶: Novozyme18(諾維信公司),酶活為≥高生長(cháng)迅速、產(chǎn)量高適應性強“。若將其轉化為250ug,30c0GU/mL燃料乙醇,不但可提供車(chē)用清潔能源,而且可將其資1.1.3菌種和種子液培養源化利用。故柳枝稷產(chǎn)乙醇的研究具有非常廣闊的Pichia.stipitis CBS6054(ATCC) Saccharomyces應用前景。cerevisiae y5( CGMCC2660中國普通微生物保藏管理本研究首先在溫和條件下對柳枝稷進(jìn)行稀酸水服務(wù)中心)。兩瓶100mL無(wú)菌的YPD液體培養基中解,將柳枝稷中的半纖維素轉化為木糖,同時(shí)降低水分別接入一環(huán)CBS054和Y5,30℃,150rmin搖床振解液中的抑制劑濃度。對以木糖為主要可發(fā)酵糖的蕩培養,Y5和CBS6054分別培養14h和12h,種子液稀酸水解液進(jìn)行乙醇發(fā)酵然后對稀酸水解后的剩中菌體含量分別為33g/L和3g/L余固體用氫氧化鈉預處理,接著(zhù)將堿預處理后的固12溫和條件稀酸水解體物進(jìn)行酶解,最后將酶解后得到的葡萄糖進(jìn)行乙將粉碎過(guò)篩后的柳枝稷混勻,每個(gè)樣品按下述醇發(fā)酵。該過(guò)程既能得到高纖維素和半纖維素轉化方法處理:稱(chēng)取2g粉碎后的柳枝稷,加入16m2%率,同時(shí)也避免了高濃度發(fā)酵抑制劑的產(chǎn)生,得到了稀硫酸,135℃,lmin。收集水解液并對葡萄糖、木糖高的乙醇產(chǎn)量。和抑制劑的濃度進(jìn)行分析,然后將固體水洗至pH中1材料與方法性,50℃烘干作為堿處理樣品。13NaOH預處理材料1.3.1NaOH濃度對堿處理效果的影響收稿日期:200901-19基金項目:國家高新技術(shù)發(fā)展研究(863)計劃(2007AN57405:2007AA1072);北京市科委項目(Y00060000通訊作者:楊秀山(1946-),男教授博士生導師,主要從事微生物學(xué)酶和發(fā)酵工程微生物與清潔能源方面的研究。1710太陽(yáng)能學(xué)報30卷取稀酸預處理后的柳枝稷,分別用1%、2%、樣品中的乙醇含量。色譜條件:柱溫80℃,注射室溫3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的NaOH溶液,度150℃,輔助檢測器溫度180℃,進(jìn)樣量 lule液固比10:1,60℃,48h,水洗烘干后進(jìn)行酶解。濾液1.6.3抑制劑濃度測定進(jìn)行葡萄糖和木糖含量分析用 Hewlett Packard5890 SeriesⅡ氣相色譜儀分析1.3.2液固比對堿處理的影響樣品中的抑制劑含量。色譜條件:柱溫120℃,注射取稀酸預處理后的柳枝稷按1.3.1所得最佳室溫度200℃,輔助檢測器溫度200℃,進(jìn)樣量lμ。NaOH溶液濃度,分別以液固比(mLg未被酸解的柳1.6.4纖維素酶活(FPU)測定枝稷)2:1、4:1、6:1、8:1、10:1、12:1在60℃浸泡48h,酶活定義:50℃保溫60min的條件下,每毫升酶水洗烘干后進(jìn)行酶解。對酶解液進(jìn)行葡萄糖和木糖液每分鐘產(chǎn)生 lumo的葡萄糖為一個(gè)酶活力單位。含量分析。16.5轉化率計算方法1.3.3時(shí)間對堿處理的影響C=HxV×90%/(W,xR)取稀酸預處理后的柳枝稷優(yōu)化的NaOH溶液式中,C—纖維素或半纖維素的轉化率,%;濃度和液固比在60℃分別處理6、12、18、24、30、36、Y—葡萄糖或木糖的濃度,gmL;V——酶解液的42、48h,水洗,50℃烘干,酶解,對酶解液進(jìn)行葡萄糖體積,mL;W,柳枝稷樣品質(zhì)量,g(本實(shí)驗每個(gè)樣和木糖含量分析。品質(zhì)量為2g);R——纖維素(30.0%)或半纖維素1.4酶解(25.5%)的含量。取定量12小節中烘干的樣品,加入20mLpH值為4.8、含0.5%6PC0*度為005mM的檸2結果與討論檬酸緩沖溶液。酶量為每克樣品加3FPU纖維素酶2.1溫和條件酸解和30CBU纖維二糖酶。50℃,200r/min,48h,測葡萄酸解后水解液經(jīng)高效液相和氣相色譜測定,纖維糖和木糖濃度。素和半纖維素的轉化率分別為2779%和6093%,乙15乙醇發(fā)酵酸和糠醛濃度分別為220g/L和137g/L5HMF(5羥1.5.1溫和條件稀酸水解液乙醇發(fā)酵甲基糠醛)不可測出。由此可以看出,溫和條件下大取12小節方法所得的酸解液用ca(OH)2調部分半纖維素被轉化成木糖,同時(shí)水解液中的抑制劑pH至50,每個(gè)三角瓶(250mL)中加入1mL所得濃度很低,但纖維素的轉化率也很低。液加入10gL酵母音和20gL蛋白胨,115℃滅菌2.2堿處理條件優(yōu)化25mn接種酵母菌Y5和CBO4各10mL種子液,2.2.1NOH濃度對堿處理效果的影響30℃,80r/min,每4h取樣測定糖和乙醇濃度。由圖1可以看出NaOH濃度對酸解后剩余固體1.5.2酶解液乙醇發(fā)酵中纖維素的轉化率有很大影響,6%NaOH處理后的用優(yōu)化后的堿解條件預處理樣品,酶解后取100mL酶解液加入20g/L蛋白胨和10g/L酵母肯,放入250mL三角瓶中溶解(15℃滅菌25min)。接入l0mLY5種子液,30℃,80r/min培養。16分析方法纖維素1.6.1糖濃度分析半纖維素高效液相色譜儀(High- liquid chromatographyHPLC, Waters2690)。測定樣品中葡萄糖和木糖的含量。測定條件:氨柱(200×4.6mm),柱溫40℃NaOH溶液濃度/%wae410示差檢測器流動(dòng)相:V(乙腈):v(水)=80:20,流速lmL/min,進(jìn)樣量20L圖1NaOH溶液的濃度對堿處理的影響1.6.2乙醇測定ect of the concentration of NaoH solution用 Hewlett Packard5890seisⅡ氣相色譜儀分析on alkali-pretreatment12期段仰凱等:改進(jìn)的柳枝稷預處理方法及乙醇發(fā)酵研究1711固體經(jīng)酶解后纖維素的轉化率(66.417%)比未處理直接酶解的纖維素轉化率(3356%)提高了近1倍。這是因為NaOH強的脫木質(zhì)素作用6極大地促進(jìn)了酶解效率。當NaOH濃度高于6%時(shí),纖維素轉化率基本不再提高,這可能是由于6%NaOH已足夠去除汗維素木質(zhì)素的影響,因此可將6%NaOH濃度用于下一步半纖維素實(shí)驗。此外,在圖中還可發(fā)現,當NaOH濃度小于2%時(shí),固體中含有的少量半纖維素可以轉化為木0糖,但當NaOH濃度大于2%時(shí)酶解得不到木糖,這時(shí)間h是由于大于2%的NaOH濃度使半纖維素破壞。圖3時(shí)間對堿處理的影響2液固比對堿處理的影響Fig 3 The eifect of time on alkali-pretreatment由圖2可以看出,液固比對纖維素的轉化率的本實(shí)驗證明,用堿浸泡可以大幅提高纖維素的轉影響較大當液固比為8:1時(shí),纖維素的轉化率達到化率。這是因為木質(zhì)纖維素有高度復雜的結構,這種最高,進(jìn)一步增加液固比不再會(huì )提高纖維素的轉化結構影響并限制了聚糖被水解成可發(fā)酵的單糖,率,這可能是由于在液固比81時(shí),幾乎所有的木質(zhì)木質(zhì)素被認為最重要的限制酶解的因素,而NH恰素都被溶解。另外,當液固比在(1)-(61)范圍恰可以去除木質(zhì)素并對纖維素起到潤漲作用內時(shí)酶解液中可檢測到少量的木糖,而當液固比大2.,3乙醇發(fā)酵于6:1時(shí)木糖消失。分析其原因可能是低的液固比231溫和條件稀酸水解液乙醇發(fā)酵導致了低的脫木質(zhì)素和低的半纖維素破壞效果,而Y5和CBS6054混合菌發(fā)酵稀酸水解液產(chǎn)乙醇當液固比大于6:1時(shí),半纖維素全部被破壞并被洗結果如圖4所示。葡萄糖和木糖代謝完全所用的時(shí)掉。因此液固比8:1用于下一步實(shí)驗。間分別為12h和%6h。最終產(chǎn)生的乙醇濃度和產(chǎn)率分別為14.519g/L和0.441g乙醇/g葡萄糖達到了乙醇理論產(chǎn)率的8642%,乙醇產(chǎn)生速率為0.151g/Lh結果說(shuō)明,溫和條件下的稀酸水解液中抑制劑濃度很低并沒(méi)有對混合菌的發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用,并且在96h將溫和條件稀酸水解液中的木糖代謝完全得到一纖維素了較高的乙醇產(chǎn)率。一半纖維素葡萄糖木糖乙醇液固比/mLg圖2液固比對堿處理的影響Fig. 2 The effect of liquid-solid ratio on alkali-pretreatment22.3時(shí)間對堿處理的影響由圖3可以看出,當浸泡時(shí)間為24h,堿處理對酶解的促進(jìn)作用最大得到了最高的纖維素轉化率但浸泡時(shí)間超過(guò)24h,促進(jìn)作用不明顯,這可能是因為隨著(zhù)時(shí)間h圖4溫和條件稀酸水解液的混合菌乙醇發(fā)酵浸泡時(shí)間的延長(cháng)已被溶解的木質(zhì)素發(fā)生了絮凝作用。Fig 4 The fermentation of the dilute-sulfuric acid綜上所述,堿處理最優(yōu)條件為NaOH6%、液固hydrolysate by co-culture比8:1、24h,處理后的固體經(jīng)酶解后得到纖維素轉化2.3.2酶解液乙醇發(fā)酵率為6647%,半纖維素轉化率為零。加上溫和條件下稀酸水解得到的糖,總的纖維素轉化率為利用水解液發(fā)酵產(chǎn)乙醇實(shí)驗結果如圖5所示,94.26%半纖維素(木糖)的轉化率為6093%。Y5在12h將葡萄糖全部代謝,最終的乙醇濃度和產(chǎn)率分別為10.282g/L和0486g乙醇/g葡萄糖達到1712太陽(yáng)能學(xué)報30卷了乙醇理論產(chǎn)率的95.29%,乙醇產(chǎn)生速率為biomass: Technology, economics, the environment, and poli0.86g/L·h,表現出了較好的結果。[J]. Ann Rev Energy Environ, 1996, 21: 403-465[2] Ragauskas AJ, williams C K, Davison B H, et al. The pathforward for biofuels and biomaterials[J]. Science, 2006, 311葡萄糖(5760):484-489[3]吳斌,胡勇,馬璐,等.柳枝稷的生物學(xué)研究現狀及其生物能源轉化前景[冂.氨基酸和生物資源[4] Porter C L. An analysis of variation between upland and low-nd switchgrass, Panicum virgatum L[J].Central Oklahoma圖5酵母菌Y5對酶解液的乙醇發(fā)酵[5] Chose T K. Measurement of cellulase activities[ J]. Pure Ap-Fig. 5 The fermentation of the enzymatic hydrolysate by Y5pl Chem,1987,59(2):257-68.3結論[6 Hendriks A W M, Zeeman G. Pretreatment to enhance the綜合上所述,可以得出:溫和條件下的稀酸水解digestibility of lignocellulosic biomass[J]. Bioresourse Techn-液利用復合菌對水解液進(jìn)行乙醇發(fā)酵,并未受到任cg,m0,00:1018柳枝稷得到了主要含木糖和低濃度抑制劑的水解7] Zhao Xuebing, Peng Feng, Cheng Keke,et al.Enhancementof the enzymatic digestibility of sugarcane bagasse by alkali-何抑制,得到了很高的乙醇產(chǎn)率;優(yōu)化條件的堿處理peracetic acid pretreatment[ J]. Enzyme and Microbial Techn后,纖維素轉化率為6647%,加上溫和條件下稀酸olog,2009,44:1723水解得到的糖總的纖維素轉化率為926%,半纖[8] Eriksson.,Bwm.,TmdF. Mechanism of surfactant維素(木糖)的轉化率為60.93%,得到了較高的纖維effect in enzymatic hydrolysis of lignocellulose[ J].Enzyme素的轉化率;堿解后固體經(jīng)酶解,酶解液中的葡萄糖Microb Technol, 2002, 31: 353-64被酵母菌Y5高效轉化為乙醇。本實(shí)驗利用分步預9]BiA, Gilkes N,KiA,etal. Weak lignin-binding處理柳枝稷分步發(fā)酵,避免了高濃度抑制劑對發(fā)酵enzymes-a novel approach to improve activity of cellulases for影響,實(shí)現了纖維素和半纖維素的高效利用,但堿處hydrolysis of lignocellulosics[J]. Appl理過(guò)程中水洗增大了成本,這需要在以后試驗中對2005,121:163-170NaOH溶液的回收和水的重復利用做進(jìn)一步研究。[10] Palonen H, Tjemeld F, Zacchi G, et al. Adsorption of Tri-chodemareesei CBH I and EG I and their catalytic domains參考文獻]on steam pretreated softwood and isolated lignin[J].J Bio-[1] Lynd L R. Overview and evaluation of fuel ethanol from cellulosictechnol,2004,l07:65-72MODIFIED TECHNOLOGY OF SWITCHGRASS PRETREATMENTFOR ETHANOL PRODUCTIONDuan Yangkai, Tian Shen, Yu Yong, Zhou Guixiong, Yang XiushanCapital Normal Uninersity, College of Life Scienc, Beiing 100048,ChinaAbstract: In order to effectively pretreat switchgrass, increase the conversion of cellulose and hemicellulose, reduce theinhibitory compounds concentration, switchgrass was pretreated by dilute acid hydrolysis at moderate conditions, the solidresidue was subsequently treated by alkali-pretreatment and followed by enzymatic hydrolysis. The overall conversion rateof cellulose and hemicellulose was 94. 26% and 60.93%0, respectively, dilute-acid hydrolysate can be fermented to ethanol with the yield of 0. 44lg ethanol/g sugar, and the enzymatic hydrolysate can be easily utilized to produce ethanol withethanol yield of 0. 486g ethanol/g sugar. This study provides a new way for fuel ethanol production from switchgrassKeywords: switchgrass; moderate conditions; dilute-acid hydrolysis; conversion of cellulose and hemicellulose; ethanolfermentation: inhibitor