響應曲面法優(yōu)化大粒車(chē)前子苯乙醇苷乙醇回流提取工藝

第39卷第4期南昌大學(xué)學(xué)報(理科版)Vol 39 No 42015年8月Journal of Nanchang University( Natural Science)Aug.2015文章編號:1006-0464(2015)04037404響應曲面法優(yōu)化大粒車(chē)前子苯乙醇苷乙醇回流提取工藝萬(wàn)茵,梁玉禧,李益珍ψ,鄒彬·,皮璟漁1:2,張倫寧3,聶少平l,謝明勇1(1.南昌大學(xué)a.食品科學(xué)與技術(shù)囯家重點(diǎn)實(shí)驗室;b.食品學(xué)院2.江西省藥物研究所,江西南昌330029;3.萍鄉市食品藥品檢驗所,江西萍鄉337055)摘要:在單因素試驗的基礎上,研究提取溫度(℃)、乙醇體積分數(v·v1)及液料比(mL·g1)等因素對苯乙醇苷類(lèi)提取得率的影響,優(yōu)化車(chē)前子苯乙醇苷的乙醇回流提取工藝。應用 Design-Expert.8.0.6軟件進(jìn)行響應曲面分析,模擬得到二次多項式回歸方程的預測模型。苯乙醇苷的最佳提取工藝條件為溫度90℃、乙醇體積分數71%、液料比47mL·g-1,在此條件下苯乙醇苷的提取得率為0.99%,與模型預測值1.02%吻合良好。優(yōu)化后的工藝參數可為乙醇回流提取大粒車(chē)前子中苯乙醇苷的產(chǎn)業(yè)化提供指導關(guān)鍵詞:響應曲面法;大粒車(chē)前子;苯乙醇苷;乙醇回流提取中圖分類(lèi)號:R283.6文獻標志碼:AOptimization of ethanol reflux extraction of phenylethanoid glycosidesfrom Semen Plantaginis with Response surface techniqueWAN YinlaIb LIANG Yuxi b. LI Yizhen b, ZOU Bina, Ib. PI Jingyu,2ZHANG Lunning, NIE Shaopinga, XIE Mingyong(la. State Key Laboratory of Food Science and Technology. Nanchang University, Nanchang 330047. China;1b. College of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, ChinaIc Sino-German Food Engineering Center, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. Jiangxi Instituteof Materia Medica, Nanchang 330029, China; 3. Institute for Food and Drug Control, Pingxian 337055, China)Abstract: The study was aimed to optimize the ethanol reflux extraction conditions of phenylethanoid glycosides from Semen Plantaginis. Three factors such as extraction temperature (C), ethanol concentration(%)and ratio of solvent to material (mL .g) were investigated on the basis of single-factor experiments. The predictive equation was obtained by fitting the experimental data to the box-Behnken Design( BBD)model with Design- Expert.8.0. 6 software. The results showed that the optimum ethanol extractionconditions were optimized extraction temperature 90C, ethanol concentration 71 and the ratio of solventto material 47 mL .g. Under these conditions, the mean extraction yield of phenylethanoid glycosideswas0.99%, which was in good agreement with the predicted model value 1. 02%. The optimized parame-ters could provide the guidance on the industrialization of ethanol reflux extraction of phenylethanoid glycosides from Semen plantaginisKey words: response surface methodology Semen Plantaginis; phenylethanoid glycosides; ethanol reflux extraction苯乙醇苷類(lèi)化合物是指以β葡萄糖為母核,通生物,有羥基、甲氧基取代的?；蛱腔囊活?lèi)天然過(guò)糖苷鍵連接羥基、甲氧基等取代的苯乙醇及其衍糖苷,通常含有酯鍵及氧苷鍵,結構通式見(jiàn)圖1。研稿日期:2015-03-20。第4期萬(wàn)茵等:響應曲面法優(yōu)化大粒車(chē)前子苯乙醇苷乙醇回流提取工藝究表明,苯乙醇苷類(lèi)化合物具有廣泛而且顯著(zhù)的生儀器有限公司),DFY-500搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機理活性,如免疫調節、抗氧化、抗病毒、抗誘變、抗炎、(溫嶺市林大杋械有限公司),旋轉蒸發(fā)儀RE-52抗菌、抗腫瘤、增強記憶、抗血小板、保肝強心等作(上海亞榮生化儀器廠(chǎng)),DHG-9053型電熱恒溫用-2,是多種藥品和保健食品的主要有效成分鼓風(fēng)干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司),SHBⅢ循環(huán)水式真空泵(杭州瑞佳精密科學(xué)儀器有限公司),UV-7504單光束紫外一可見(jiàn)分光光度計(上R海精科實(shí)業(yè)有限公司)。2實(shí)驗方法諸多因素影響乙醇回流提取大粒車(chē)前子中苯乙圖1苯乙醇苷類(lèi)化合物的結構通式醇苷的提取得率,如大粒車(chē)前子的粉碎度、液料比、乙從自然界分離得到的苯乙醇苷類(lèi)化合物主要存醇體積分數、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數等。通在于雙子葉植物中,如列當科、玄參科、木樨科、木蘭常乙醇回流提取有效成分時(shí),提取2次可以將大部分科、薔薇科、爵床科、菊科、苦芭苔科、馬鞭草科和唇形有效成分提取出來(lái),提取2次以后得率提高不大,從節約成本和提高產(chǎn)能考慮,本實(shí)驗將提取次數定為2科等植物中3,近年來(lái)不斷有報道從小檗科、車(chē)前科馬齒莧科等多種植物中提取出苯乙醇苷類(lèi)化合物。次。選擇其他因素進(jìn)行單因素試驗,根據結果選取影響顯著(zhù)的因素分別設置3個(gè)水平進(jìn)行響應面優(yōu)化,獲車(chē)前子( Semen plantaginis),又名車(chē)前實(shí)、蝦蟆衣子、豬耳朵穗子、鳳眼前仁,為多年生草本車(chē)前得車(chē)前子苯乙醇苷的回流提取最佳工藝條件2.1苯乙醇苷含量的測定科植物車(chē)前( Plantago asiatica L.)或平車(chē)前2.1.1標準曲線(xiàn)的繪制精密稱(chēng)取10mg毛蕊花( Plantago depressa willd的干燥成熟種子,前者稱(chēng)為大粒車(chē)前,后者又稱(chēng)小粒車(chē)前。車(chē)前子是江釋至刻度,搖勻,得到濃度為1.0mg,mL的標準西省道地藥材之一,味甘性寒,入腎、膀胱、肝、肺經(jīng),溶液。然后依次吸取1.0,2.0,2.5,3.0mL于4個(gè)功能利水通淋、滲濕止瀉、清肝明目、清熱化痰,藥用10mL容量瓶,定容,得到濃度為0.10,0.20,0.25價(jià)值顯著(zhù)。近年來(lái)研究發(fā)現來(lái)源豐富、價(jià)格低廉的0.30mg·mL-的標準溶液。分別吸取5個(gè)不同濃車(chē)前子中含有較高的苯乙醇苷化合物。度的標準液400μL,各加入0.5mol·L.鹽酸溶液苯乙醇苷屬于極性化合物采用乙醇回流提取,2mL、10%亞硝酸鈉溶液0.4m1L、10%鉬酸鈉溶液具有高得率、工藝操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。因此本文采用1.6mL和2mol.L-1氫氧化鈉溶液2mL,蒸餾水單因素實(shí)驗和響應曲面法對大粒車(chē)前子中苯乙醇苷定容至10mL,搖勻,靜置顯色10min后在波長(cháng)525的溶劑回流提取條件進(jìn)行優(yōu)化,得到車(chē)前子苯乙醇m下測定吸光度值,并以吸光度值A為縱坐標、毛苷的回流提取最佳工藝條件,這對產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)苯乙蕊花苷濃度C為橫坐標繪制標準曲線(xiàn)。得到線(xiàn)醇苷具有現實(shí)意義性回歸方程如下1材料與儀器A=1.0918C-0.0582R=0.9991(1)可見(jiàn)毛蕊花苷質(zhì)量濃度在0.1~1.0mg1.1原料mL1與吸光度值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系大粒車(chē)前子( Seeds of Plantago asiatica I.),2.1.2總苯乙醇苷的提取及得率測定精密稱(chēng)取產(chǎn)自江西吉安。5g車(chē)前子粉末置于圓底燒瓶?jì)?加入乙醇進(jìn)行回1.2試劑流提取,過(guò)濾,濾液滅壓濃縮定容至100mL。再精乙醇、石油醚(60~90℃)、正丁醇、鹽酸、氫氧密吸取400,L,根據2.1.1的方法進(jìn)行顯色反應,化鈉、鉬酸鈉、亞硝酸鈉,以上均為國產(chǎn)分析純;甲10min后在525mm下測量吸光度值,根據公式(1)醇,為國產(chǎn)色譜純;毛蕊花苷標準品(純度≥98%),計算苯乙醇苷的質(zhì)量濃度,再根據公式(2)和(3)計購自中國藥品生物制品檢定所。算提取液中苯乙醇苷質(zhì)量和苯乙醇苷提取得率:南昌大學(xué)學(xué)報(理科版)2015年V為定容體積(mL)。變量選擇3個(gè)水平,分別以-1、0、1進(jìn)行編碼.以苯苯乙醇苷提取得率/%=苯乙醇苷含量(ng)×乙醇苷得率Y為響應值,利用 Design-Expert100%/M(mg)(3)8.0.6軟件對試驗結果進(jìn)行回歸擬合分析。式中:M為車(chē)前子原料質(zhì)量(mg)2.2單因素試驗3結果與討論2.2.1粉碎度車(chē)前子粉碎,過(guò)不同目篩,得到203.1單因素試驗結果40日、40~60日、60~80日、80目以上這4種不乙醇回流提取苯乙醇苷單因素結果見(jiàn)圖2。同粉碎度的樣品。精密稱(chēng)取這4種車(chē)前子粉各5g由圖2(a)可知,在粉碎度單因素試驗中,粉碎按10:1的液料比加入75%乙醇溶液,分別于80度為40~60目和60~80目時(shí)苯乙醇苷提取得率相℃加熱回流2h,抽濾,濾渣依樣進(jìn)行第2次提取,抽差不大,且均明顯髙于其他粉碎度。提取過(guò)程包括濾,合并兩次濾液,濃縮定容,按2.1.2方法測定提擴?散、滲透、溶解、吸附等復雜過(guò)程,粉碎度越大顆粒取液吸光度值,計算苯乙醇苷提取得率,比較不同粉越小,可增加固液傳質(zhì)表面積,苯乙醇苷越容易溶碎度對苯乙醇苷提取得率的影響。出,提取效率越高,但是原料粉碎度越大,粉碎的成2.2.2乙醇體積分數精密稱(chēng)取4份車(chē)前子,每份本也越高,且顆粒太小提取時(shí)容易帶出大量黏性多5g粉碎度參照2.2.1結果,按10:1的液料比加糖,增加固液分離難度,為簡(jiǎn)化后續操作,因此選定入不同體積分數的乙醇溶液(25%,50%,75%,40~80目為最佳粉碎度粉碎度。%),分別于80℃加熱回流,提取時(shí)間與次數同乙醇體積分數單因素試驗結果見(jiàn)圖2(b),結果2.2.1,按2.1.2測定提取液吸光度值.計算苯乙醇表明乙醇體積分數為75%時(shí)出的苯乙醇苷提取得苷提取得率,比較不同乙醇體積分數對苯乙醇苷提率最高,100%次之,25%和50%均更低。其原因是取得率的影響。苯乙醇苷的分子結構是羥基苯乙醇基以糖苷鍵連接2.2.3液料比乙醇體積分數精密稱(chēng)取4份車(chē)前到β吡喃葡萄糖上·隨著(zhù)乙醇體積分數升高,溶劑極子,每份5g,粉碎度參照2.2.1結果,按不同的液料性降低,更易溶解在高濃度的乙醇水溶液中。且比(10:1,20:1,30:1,40:lmL·g-)加人乙醇低濃度的乙醇水溶液易提取出多糖,導致提取液的溶液(乙醇體積分數參照2.2.2結果),分別于80℃粘度加大,增加過(guò)濾的難度。過(guò)高乙醇濃度不僅會(huì )加熱回流,提取時(shí)間與次數同2.2.1,按2.1.2測定降低提取率,也會(huì )提取出一些醇溶性雜質(zhì),因此選擇提取液吸光度值,計算苯乙醇苷提取得率,比較不同75%的乙醇體積分數作為響應面試驗中的編碼θ進(jìn)液料比對苯乙醇苷提取得率的影響。行后續試驗。2.2.4提取溫度精密稱(chēng)取4份車(chē)前子,每份5g,液料比單因素試驗結果見(jiàn)圖2(c),結果顯示,粉碎度參照2.2.1結果,乙醇體積分數參照2.2.2隨著(zhù)液料比的不斷增大.苯乙醇苷提取得率也在不結果,液料比參照2.2.3結果,分別于不同溫度下斷提高,且組間差別明顯。根據費克定律可知,傳(20℃,40℃,60℃,80℃)加熱回流,提取時(shí)間與質(zhì)效率與溶質(zhì)的濃度梯度呈正比,液料比越大,液固次數同2.2.1,按2.1.2測定提取液吸光度值計算兩相中的溶質(zhì)濃度梯度越明顯,有利于溶質(zhì)的溶出苯乙醇苷提取得率,比較不同提取溫度對苯乙醇苷增加苯乙醇苷提取得率。但考慮到節約成本和后續提取得率的影響。操作處理等綜合因素,為避免濃縮工藝操作負荷過(guò)2.2.5提取時(shí)間精密稱(chēng)取4份車(chē)前子,每份5g,大和能耗過(guò)高,故選擇液料比40mL·g作為響應粉碎度參照2.2.1結果,乙醇體積分數參照2.2.2面試驗中的編碼0進(jìn)行后續試驗結果,液料比參照2.2.3結果,提取溫度參照2.2.4提取溫度單因素試驗結果圖2(d)表明,隨著(zhù)溫結果,加熱回流不同時(shí)間(1,2,3,4h),次數同2.2.度升高,苯乙醇苷提取得率得率不斷增加,且增加幅1,按2.1.2測定提取液吸光度值,計算苯乙醇苷提度明顯,由此可知溫度是影響苯乙醇苷得率的主要取得率,比較不同提取時(shí)間對苯乙醇苷提取得率的因素。由于溫度升高,分子熱運動(dòng)加快,增加溶劑擴影響。散速度和溶質(zhì)溶出速度,提高提取效率。但是溫度2.3響應曲面優(yōu)化試驗過(guò)高不僅能源消耗高,還容易使苯乙醇苷活性下降。第4期萬(wàn)茵等:響應曲面法優(yōu)化大粒車(chē)前子苯乙醇苷乙醇回流提取工藝377提取時(shí)間單因素試驗結果見(jiàn)圖2(e),提取時(shí)間0.9770.9860.999從1h增加到2h,苯乙醇苷提取得率變化明顯,而提取時(shí)間超過(guò)2h之后苯乙醇苷提取得率開(kāi)始趨近于平緩,過(guò)長(cháng)的高溫提取時(shí)間,不僅能耗高而且會(huì )對蜜0.6苯乙醇苷提活性造成不利影響,由此選取提取時(shí)間2h為宜。綜上所述,選取了對影響乙醇回流提取大粒車(chē)0-4040-6060-80≥80前子中苯乙醇苷提取得率影響顯著(zhù)的3個(gè)因素,即e)提取時(shí)間/h乙醇體積分數、液料比和提取溫度圖2乙醇回流提取單因素試驗結果(n=33.2響應曲面試驗結果表1乙醇回流提取實(shí)驗因素與水平對照表根據單因素的試驗結果,響應曲面試驗因素與因素水平選擇如表1所示,3個(gè)因素中,乙醇體積分數為水平A乙醇體積分數/B液料比/C溫度/(mlA、液料比為B、溫度為C。750.6060.6430.60.60.546表2為不同條件下所測得的苯乙醇苷得率,利0.4用 Design-Expert8.0.6軟件對試驗數據進(jìn)行多元回歸擬合,得到乙醇體積分數(A)、液料比(B)、溫度(C)與苯乙醇苷得率(Y)之間的二次多項回歸方程20~4040~6060~80≥80為:Y=+0.93-0.11×A+0.091×B+0.20×C+(a)粉碎度/目0.076×AB-0.072×AC-0.063×BC-0.17×A20.7370.7080.030×B2-0.19×C2。621份0.6表2 Box-Behnken設計方案及實(shí)驗結果(n=3)翠04編碼水平試驗號苯乙醇苷出C得率/00.930b)乙醇體積分數/%1234567890.8690.9550,9300.790.8260,34510.931職0610.382040.9300.9300.858液料比/(mL·g-1)2345670.94經(jīng)過(guò)方差分析得到表3數據。顯著(zhù)性檢驗結果0.662表明,該模型的P值<0.0001,自變量一次項A罵0.6B、C和二次項A2、C2均差異極顯著(zhù),二次項AB、0.269AC、BC差異高度顯著(zhù),表明該模型選用的二次項模型具有統計學(xué)意義;擬合度R2=0.9940,表明預測南昌大學(xué)學(xué)報(理科版)2015年的模型,說(shuō)明回歸方程能切實(shí)解釋各因素與響應值的交互作用越顯著(zhù),橢圓排列越密集,則表明因素的間的真實(shí)關(guān)系,具有高擬合度、可信度,可用來(lái)對乙變化對響應值變化的影響越大1。由這3組圖可醇回流提取車(chē)前子苯乙醇苷的得率進(jìn)行預測?ˉ。知,從響應曲面坡度來(lái)看,溫度的影響大于乙醇體積響應面圖和等高線(xiàn)圖直觀(guān)地反映了任意2個(gè)因分數,乙醇體積分數的影響又大于液料比,從等高線(xiàn)素對苯乙醇苷得率的影響,它是將建立的回歸模型圖形狀來(lái)看,兩兩因素間相互作用均比較明顯。中其余2個(gè)因素固定在0水平所得到的,具體交互3.3驗證試驗及結果影響結果見(jiàn)圖3。在響應面圖中,如果響應曲面坡經(jīng)過(guò)優(yōu)化后,得到提取最優(yōu)條件為溫度89.3度若越陡峭,則表明響應值越敏感。在與響應面對℃、乙醇體積分數71.1%、液料比47.1mL·g應的等高線(xiàn)圖中,曲線(xiàn)離中心越近,對應的響應值也考慮到實(shí)際條件,修正工藝參數為溫度90℃、乙醇越大,若等高線(xiàn)形狀越呈橢圓形,表明2個(gè)自變量間體積分數71%、液料比47mL·g-。按照修正工表3方差分析結果方差來(lái)源平方和自由度均方差Prob>F顯著(zhù)性模型0,0950.098<0.0001ABCA0,0670.06789.85<0,0001關(guān)著(zhù)爺0.33441.41<0.00010.02331AC0.0200.0200.00120,0160.13171.46<0.0001第A(yíng)BC殘3,727E003.727E0035,030.05990.15204.49<0.00017,414E004擬5.189E0031.730E003純誤差0,0000.86擬合度R2=0.9940校正擬合度R3;=0.9862信噪比=29.977注:“*差異極顯著(zhù),P<0.001;*差異高度顯著(zhù),P<0.01;*差異顯著(zhù),P<0.05;◎非顯著(zhù),P>0.0545.0040.00B:液料比300600600:乙醇體積分數C:溫度608苯乙醇苷得率00604醇體積分數50.00苯乙醇苷得率100.00土實(shí)76.0030.00600066.00720078.0084.0090.0068.00A:乙醇體積分數60.006,0072.00780084.0090.00第4期萬(wàn)茵等:響應曲面法優(yōu)化大粒車(chē)前子苯乙醇苷乙醇回流提取工藝379參考文獻[1 MATSUI T, ITO C, ITOIGAWA M, et al. Anti-In-ds and PhyN2]宋光西,馬玲云,魏鋒,等.苯乙醇苷的分布及藥理活10004500性研究進(jìn)展[J.亞太傳統醫藥,2011,7(4):169-171.C:溫度7690030030B:液料比[3 SERAFINI M, DI FABIO A, FODDAI S, et al. TheOccurrence of Phenylpropanoid Glycosides in Italia苯乙純苷得Orobanche SppLJ] Biochemical Systematics and Ecol1995,23(7):855-85892.00[4]侯寬昭.中國種子植物科屬辭典[M.北京:科學(xué)出版社,1958型845 OLENNIKOV D N, TANKHAEVA L M. STOLBIKOVA A V. et al. Phenylpropanoids and Polysaccharides from Plantago Depressa and P. media Growing inBuryatia[J]. Chemistry of Natural Compounds, 201160.0066.0072.0078.0084.0090.0047(2):165-169B:液料比L6 ARNOW L E Colorimetric Determination of the Com(c)溫度、液料比ponents of 3, 4-dihydroxy-phenyl-alanine/tyrosine圖3各實(shí)驗因素對苯乙醇苷得率影響的Mixtures[J]. Journal of Biological Chemistry. 1937響應面圖和等高線(xiàn)圖118(2):531-537藝參數,經(jīng)過(guò)3次平行試驗,苯乙醇苷提取得率的嚴[η]張潔,李夢(mèng)青,聶媛,等.葡萄穗軸中白藜蘆醇、原花色素提取工藝的研究[J.河北工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,37均實(shí)測值0.99%,與響應曲面分析中的預測值1.02%非常接近,偏差小。因此該工藝條件用于提取[8]李宏燕,續京,中藥有效成分浸提過(guò)程的動(dòng)力學(xué)模型車(chē)前子中苯乙醇苷具有實(shí)際應用價(jià)值。分析[].安徽農業(yè)科學(xué),2008,36(25):10730-10731[9 ALONSO-SALCES R M, KORTA E, BARRANCO4結論A,et al. Pressurized Liquid Extraction for the Deter目前提取苯乙醇苷類(lèi)化合物多從列當科植物肉mination of Polyphenols in Apple[j] Journal of Chro-matography A.2001,933(1):37-43.蓯蓉和馬鞭草科枇杷葉紫珠中提取,得率分別為5.[101 BEZERRA M A, SANTELLIR EOLIVEIRA EF,t76%12、6.69%1,但這兩類(lèi)藥材受生長(cháng)條件所限,al. Response Surface Methodology (RSM)as a Tool來(lái)源少且價(jià)格昂貴。為了進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)苯乙醇for Optimization in Analytical Chemistry [J]. Talanta苷類(lèi)化合物,尋找含量豐富、價(jià)格低廉的原料成為研2008,76(5):965-977究的熱點(diǎn)。[11 YANG B LIU X GAO Y Extraction Optimization of本研究以車(chē)前子為原料,在進(jìn)行單因素實(shí)驗和Bioactive Compounds Crocin. Geniposide and Total相應曲面優(yōu)化后的乙醇回流提取工藝參數條件下Phenolic Compounds) from Gardenia Gardenia Jas-苯乙醇苷的提取得率為0.99%,雖然低于肉蓯蓉和minoides Ellis Fruits with Response Surface Methodology [J]. Innovative Food Science & Emerging枇杷葉紫珠,但車(chē)前子在江西分布廣泛,具有來(lái)源易Technologies,2009,10(4):610-615.得、相對價(jià)格低廉的優(yōu)勢,其生產(chǎn)成本遠低于肉蓯蓉〖12]任璐,顧小紅,湯堅.栽培管花肉蓯蓉中苯乙醇苷的乙和枇杷葉紫珠。而且除苯乙醇苷外,車(chē)前子還含有醇提取工藝[].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2006,25(3)大量的多糖、黃酮等其他活性成分,綜合利用價(jià)33-36值顯著(zhù)。本研究?jì)?yōu)化后的工藝參數,運用到乙醇回13]鞏珺,麥錦富,彭素萍,等, Doehlert設計法優(yōu)化紫珠流提取大粒車(chē)前子中苯乙醇苷的實(shí)際生產(chǎn)中,對提中苯乙醇苷的提取工藝[J.中國實(shí)驗方劑學(xué)雜志高苯乙醇苷產(chǎn)品得率、降低生產(chǎn)成本具有重要指導2011,17(17):7-10[14]何永婷,朱賀年.車(chē)前子的研究進(jìn)展[J.北方藥學(xué)