熱變性和熱聚集對大豆分離蛋白溶解性的影響

1062008W29,No.07段品利寫(xiě)※基礎研究熱變性和熱聚集對大豆分離蛋白溶解性的影響葉榮飛,楊曉泉*,鄭田要,鄭恒光,朱建華,劉翀,司華靜(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院食物蛋白工程研究中心,廣東廣州510640)摘要:研究了溫度和濃度對大豆分離蛋白(SP)溶解性的影響,并用 SDS-PAGE電泳分析了其可溶部分中亞基的組成及聚集方式。結果表明,熱誘導大豆蛋白聚集生成了可溶聚集體,使得低濃度熱處理后完全變性的SPI具有良好的溶解性。關(guān)鍵詞:大豆分離蛋白;熱處理:溶解性;變性:聚集Effects of Thermal Denaturation and Aggregation on Solubility of Soy Protein IsolatesYE Rong-fei, YANG Xiao-quan, ZHENG Tian-yao, ZHENG Heng- guang, ZHU Jian-hua, LIU Chong, SI Huajing(Research and Development Center of Food Proteins, College of Light Industry and Food,South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)Abstract: The effects of temperature and concentration on the solubility of soy protein isolates(SPD) were studied, and thenthe subunit compositions and form of aggregation of soluble fractions obtained from treated SPi were analyzed by SDS-PAGE.The results showed that the totally denatured SPl after thermal treatment at low concentration have good solubility due to formationof heat -induced soluble protein aggregatesKey words: soy protein isolates(SPI); thermal treatment; solubility: denaturation; aggregation中圖分類(lèi)號:TS2017文獻標識碼:A章編號:10026630200807-010603大豆分離蛋白不僅是一種蛋白含量高的大豆產(chǎn)品脫脂豆粕山東新嘉華有限公司。而且還因具有多種功能特性而廣泛應用于各類(lèi)食品。但所用化學(xué)試劑均為分析純。是,在大豆分離蛋白的生產(chǎn)中,熱殺菌、高溫噴霧干ECP3000三恒電泳儀北京六一儀器廠(chǎng);600E蛋白燥等生產(chǎn)環(huán)節都會(huì )導致大豆蛋白發(fā)生不可逆的熱變性。純化系統美國 Waters公司; ALPHA-4冷凍干燥機日熱變性導致蛋白質(zhì)的解離,卷曲緊密結構的展開(kāi)和疏水本東京理化公司;TAQ100差示量熱分析儀美國PE公基團的暴露。由于展開(kāi)分子的大量聚集,蛋白質(zhì)的變司:CS501超級恒溫水浴鍋上海浦東躍欣科學(xué)儀器性通常會(huì )引起溶解度的下降,從而影響其功能特性,限廠(chǎng);CR2G高速冷凍離心機日本日立公司:壓力滅制其應用。但是,蛋白質(zhì)的變性不一定導致溶解性下菌鍋上海博迅公司。降,國外已有研究表明21,在一定的條件下,大豆分1.2方法離蛋白即使是完全熱變性,也能具有高溶解性。121SP的制備熱處理條件下,大豆蛋白的熱變性、聚集與溶解低溫脫脂豆粕粉碎后過(guò)60目篩。豆粕粉按1:10的性之間關(guān)系的研究,對提高大豆分離蛋白的溶解性具有料液比加水攪拌,用1 mol/L NaoH調pH至75,浸提重要的理論和實(shí)用價(jià)值。本實(shí)驗研究溫度和濃度對溶解2h后離心(8000×g,20min,4℃),取上清液用1mo性及大豆蛋白亞基組成的影響,并選取2%的溶液研究HC調pH至45,靜置05h后再次離心(500×g,20min,了可溶部分的熱變性情況和聚集物的生成,以期為大豆4℃),棄去上清液,加水并用1 mol/L NaOH調蛋白凝乳分離蛋白生產(chǎn)中的熱加工提供一定的理論指導。的pH至70,經(jīng)冷凍干燥后即得SPI。凱氏定氮法測得sPI的蛋白含量為886%。1材料與方法1.22SPI的熱處理中國煤化工w/V)分別為2%11材料、試劑與設備4%、CNMHG備三份,磁力攪拌2h,收稿日期:20071001小mw水浴)和120℃(滅菌基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(20776050);廣東省自然科學(xué)基金項目(07006508)作者簡(jiǎn)介:葉榮飛(1983-),男,碩士研究生,研究方向為糧食油脂及植物蛋白。E-mail:yeyunfeil1314@tom.com*通訊作者:楊曉泉(1965),男,教授,博士,研究方向為大豆蛋白的開(kāi)發(fā)利用。E-mail::fengyang@scut.edu.cn※基礎研究品科寶2008,vl.29No.07107鍋中進(jìn)行)加熱30min,迅速用冰浴冷卻5min,再經(jīng)高亞基(a'、α及β)通過(guò)非共價(jià)作用構成的三聚體。速分散均質(zhì)機分散后冷凍干燥。因為β-巰基乙醇可還原而斷開(kāi)二硫鍵,所以通過(guò)123溶解度的測定對比還原和非還原電泳圖可判斷亞基間是否有二硫鍵交稱(chēng)取0.5g各干燥樣品(經(jīng)熱處理的sPD,用蒸餾水聯(lián)。圖2顯示不同濃度的SP溶液在80℃下加熱30min后,其可溶部分的亞基沒(méi)有明顯變化,其中圖2(b)表明20℃).用凱氏定氮法測上清液(可溶部分)的蛋白含量。AB(分子量約為58kD仍明顯存在,說(shuō)明AB之間的二硫上清液的蛋白含量與樣品蛋白含量的比值即為溶解度。綜合圖2(a)和圖2(b)分析,構成小聚集物和大聚集物的124 SDS-PAGE電泳亞基相互作用力以二硫鍵為主。根據 Laemmli U K的方法,在不連續緩沖系統上人案集物進(jìn)行 SDS-PAGE電泳分析,濃縮膠和分離膠的濃度分別為4%和12%,考馬斯亮藍R250染色。還原電泳樣品小聚坐物緩沖液中含10mmo/LB-巰基乙醇,其他成分與非還原SDS-PAGE電泳緩沖液相同。參照123制備上清液,冷43kD凍干燥后用于電泳分析sOkD s125凝膠過(guò)濾參照1.23制備上清液,上樣量為5m1。采用20.1kDSepharose CL-6B凝膠柱,洗脫液用Tris-HCl緩沖液144kD1234567891011pH75,含有01 molL Nacl)。流速為1m/min,每3ml收集一管,收集的組分在280nm檢測。盤(pán)還原 SDS-PAGE圖譜(添加B巰基乙醇)hb.非還原 SDS-PAGE圖譜1.26差示量熱掃描(DSC)(未添加β·巰基乙醇)。1為 Marker;2為未熱處理的sP:3~7為參照1.23制備上清液,冷凍千燥后用于DSC分析。2%、4%、6%、8%和10%的SP溶液在80℃加熱30mn后可溶部分稱(chēng)取2mng樣品放入鋁盤(pán)中,加入10μ1磷酸鹽緩沖液(pH70)的還原電泳圖譜:8~11為2、%、6%和8%的SP溶液在80℃加使樣品混和均勻,參考盤(pán)為空鋁盤(pán),掃描溫度范圍為熱3mn后可浴部分的非還原電泳圖20~120℃,升溫速率為10℃/min圖2不同濃度的P溶液在80℃加熱30min后可溶部分的8PA旺E圖譜Fig 2 SDS-PAGE pattems of soluble fractions obtained from結果與分析different concentrations SPl thermally treated at boCfor 30 min圖3(b)顯示,SPI溶液在100℃下加熱30mn后,AB21溶解度測定已經(jīng)解離,表明在此熱處理條件下,AB之間的二硫鍵已斷開(kāi)。圖3(a還顯示,當濃度在6%以上時(shí),上清液即可溶部分中的B和β已不存在,但A、α'和α還明顯存在→120℃根據 Yamagishi T等習用15和7S來(lái)做的模型實(shí)驗結論可推測,此熱處理條件下A、a和a通過(guò)二硫鍵相互作用形成可溶性聚集物,而B(niǎo)和β形成了不溶聚集物濃度(%,W/V)圖1不同濃度的8P|經(jīng)不同溫度熱處理后的溶解度曲線(xiàn)Flg.1 Solubility profiles of different concentrations SPl afterthermal treatments of different temperatures圖1顯示不同濃度的SP經(jīng)不同溫度熱處理后的溶解度曲線(xiàn)。在不同熱處理溫度下,溶解度隨著(zhù)濃度的增加而明顯下降。低濃度時(shí)顯示較好的溶解性,特別是12345678910112%的SPI分別經(jīng)80、100和120℃熱處理30min后溶解度都在80%以上a還原SDs-PAGE圖譜:b非還原 SDS-PAGE圖譜;1為未熱處理的22 SDS-PAGE分析SPI大豆蛋白主要由大豆1S球蛋白 glycinin)和7S球蛋白30miV凵中國煤化工,1(β conglycinin)組成。11S是一個(gè)六聚體,它由六個(gè)酸性CNMH分的非還原電泳圖譜。圖3后可溶部分的S0SPAE圖譜亞基(A)和六個(gè)堿性亞基(B通過(guò)二硫鍵連接組成,這兩種Fig 3 SDS-PAGE patterns of soluble fractions obtained from亞基的分子量大約分別為38kD和20D。7S是類(lèi)由三種 different concentrations SPl thermally treated at100tor3omin1082008W29M.07品酗軍※基礎研究度相差不大,又因為上樣量相同,因此可確認熱處理后的SPI的第一個(gè)洗脫峰增加的主要原因是分子量較大的可溶聚集體的增加。2.84261910060120180240300360420a還原 SDS-PAGE圖譜:b非還原 SDS-PAGE圖譜:1~5為2%、%、6%、8%和10%的SPI溶液在120℃加熱30min后可溶部分的還未加熱;80℃下熱處理;c.100℃下熱處理:d.120℃下熱處理原電泳圖譜;6~10為2%、4%、6%、8%和10%的SPI溶液在120圖6$P溶液(2%)在不同溫度下加熱30mn后可溶部分的凝膠過(guò)濾圖譜℃加熱30min后可溶部分的非還原電泳圖譜Fig 6 Gel filtration chromatograms of soluble fractions obtained圖4不同濃度的sP|溶液在120℃加熱30min后可溶部分的 SDS-PAGE from SP(2%) thermally treated at different temperatures for3omnFig4 SDS-PAGE pattems of soluble fractions obtained from3結論different concentrations SPl thermally treated at 120C for 30 min31SPI的溶解性隨著(zhù)熱處理時(shí)濃度的降低而明顯升如圖4所示,分離膠中各亞基帶顏色明顯變淺,而高。2%濃度的SPI經(jīng)不同溫度熱處理后,其溶解度均在濃縮膠頂部有很明顯的聚合物形成。說(shuō)明該可溶部分能達到80%以上。主要由聚集物組成,構成聚集物的作用力不是疏水相互3280℃下熱處理時(shí),SPI部分變性,11S中的AB未作用和二硫鍵,可能是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)發(fā)生了反應而通解離:100℃熱處理時(shí),11S完全變性,AB解離,亞過(guò)共價(jià)鍵相連接?；鵄可能與a和a通過(guò)二硫鍵交聯(lián)形成了可溶聚集體23熱變性分析而B(niǎo)與β形成了不溶聚集體;120℃熱處理時(shí),蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)可能發(fā)生了某種反應而共價(jià)連接。分析表明熱誘導大豆蛋白聚集生成了可溶聚集體,使得低濃度熱處理后完全變性的SPI具有良好的溶解性參考文獻]王風(fēng)翼,錢(qián)方.大豆蛋白質(zhì)生產(chǎn)與應用M北京:中國輕工業(yè)出版-社,2004,77-8180[2 WAGNER JR, SORGENTINI D A Relation between solubility and度C℃)phobicity as an indicator of modifications during prepara-未加熱;b.80℃下熱處理;c.100℃下熱處理;d120℃下熱處理tion processes of commercial and laboratory-prepared soy protein isolatesU J Agric Food Chem, 2000, 48: 3159-3165.圖5P|溶液(21)在不同溫度下加熱30min后可溶部分的DsG圖謙王顯生不同亞基變異類(lèi)型的大豆分離蛋白凝膠質(zhì)構特性的研究門(mén)Flg.5 DSC thermograms of soluble fractions obtained from SPl中國糧油學(xué)報2006,21(3):116-120(2%)thermally treated at different temperatures for 30 min[4] ARRESE EL SORGENTINID A, WAGNERIR, ct aL. Electropboretic,solubility and functional properties of commercial soy protein isolates如圖5所示,在未經(jīng)熱處理的SPI中,7s和11S的U. J Agric Food Chem, 1991, 39: 1029-1032.變性溫度分別為74℃和95℃。2%濃度的溶液在80℃ LAEMMLI U K Cleavage of structural proteins during the assembly ofageT4小 Nature,190.22:680685下熱處理30min后,其可溶部分的7S沒(méi)有吸熱峰,說(shuō)阿 THANH V H, HIBASAKI K Major proteins of soybean seeds. A明7S已完全變性,但11S的吸收峰還很明顯。而2%濃straightforward fractionation and their characterization[]. J Agric Food度的溶液在100℃和120℃下熱處理3min后,其曲線(xiàn)為mchem,1976,24:111117PETRUCCELLI S. Thermal aggregation of soy protein isolates [].J條直線(xiàn),說(shuō)明此時(shí)蛋白質(zhì)已完全變性Agric Food Chem, 1995. 43: 3035.3041.24凝膠過(guò)濾色譜分析中國煤化工mN, e al. Isolation and electro-如圖6所示,與未加熱的SPI對照,熱處理后的CNMH1229-1237SPI的第一個(gè)洗脫峰顯著(zhù)增高。實(shí)驗測得未經(jīng)加熱的SPI陰Effect of alkali on the的溶解度為813%,與經(jīng)不同熱處理的2%的SP的溶解refunctionalization of soy protein by hydrothermal cooking[].J Am Oi