聚乙二醇修飾β-干擾素的研究

微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展2004年第32卷第3期聚乙二醇修飾β千擾素的研究徐靜,倪道明,張振龍(北京生物制品研究所,北京100024)摘要采用平均分子量為5kD的已活化的單甲氧基聚乙二醇(mPEC)對重組人β干擾素(hFNB)進(jìn)行化學(xué)修飾。優(yōu)化修飾條件,選擇對hFNβ反應性高的修飾劑制備三種不同修飾程度的修飾物,并對修飾物進(jìn)行初步檢定。三種修飾物的修飾率分別為10.12%、22.99%、42.47%;比活性分別保留為原來(lái)的93.53%、48.69%、13.18%;PEG修飾后的thINβ在pH7時(shí)的溶解度增加關(guān)鍵詞:重組人β-干擾素;聚乙二醇;化學(xué)修飾中圖分類(lèi)號:R392.11文獻標識碼:A文章編號:10055673(2004)03003004Preliminary study on chemical modification of interferon-p by polyethylene glycol XU Jing, NI Dao-ming, ZHANGZhen-Long( National Vaccine and Serum Institute, Beiing 100024, ChinaAbstract: rhIFN-B was modified by activated methoxypolyethylene glycol mPEG). with the optimization of modifying con-ditions, CC-mPEG was chosed to modify rhIFN-B and three peglated rhIFN-B were prepared, the extents of modification are10. 12%, 22.99%, and 42. 47% respectively. Specific activity of three peglated rhIFN-B is 93. 53%,48.69%, 13.18%of original rhIFN-B respectively. Polypeglation had effect on the configuration of rhIFN-B. The peglation increased the solubility of rhIFN-B at neutral pHKey words: rhIFN-B: Polyethylene glycol; Chemical modificationhFNB是一種多功能細胞因子,它可以在細胞大腸桿菌表達的 rhIFN-Bserl7為北京生物制品表面與特殊的受體結合而發(fā)揮抗病毒、抗細胞增殖和研究所中試一室提供(純度為95%以上),氰尿酰氯免疫調節作用。1993年,hFNB獲美國FDA批準用活化的單甲氧基聚乙二醇(mPEG)、琥珀酸琥珀酰于多發(fā)性硬化癥(MS)的治療。另外hFNB也可亞胺酯活化的mPEG、對硝基苯碳酸酯活化的以用于上皮癌、腎癌、基底細胞癌、乙型肝炎、丙型肝mPEG、2,4,6-三硝基苯磺酸均購自 SIGMA公司,水炎等疾病的治療。與其它基因工程類(lèi)藥物一樣,由于合茚三酮購自北京化學(xué)試劑公司,水皰性口腔炎病缺乏天然蛋白質(zhì)所具有的糖基,hFNB的半衰期短毒(VSV)、人羊膜細胞均為北京生物制品研究所中并具有一定的免疫原性、疏水性較強等特點(diǎn)因此存試一室保存, rhIFN-B ser7國際標準品購自英國在著(zhù)進(jìn)一步改善hNB的臨床治療效果的需求。NBSC1977年 Abuchowski等證明:作為治療藥物聚乙二醇2透析 rhIFN-B(PEG, polyethylene glycol)修飾的蛋白質(zhì)比未修飾的透析液為含有0.1%SDs的0.1mo/L的四硼蛋白質(zhì)更有效。目前,國內外已經(jīng)嘗試用PG對酸鈉溶液pH值為92。透析后取樣,Lowy法測多種蛋白質(zhì)類(lèi)藥物進(jìn)行修飾并取得了一定的進(jìn)展,定 rhIFN-B蛋白濃度。如腺苷脫氨酶、天冬酰胺酶、粒細胞集落刺激因子、以3修飾條件的優(yōu)化及修飾劑的選擇及兩種亞型a-千擾素的PEG修飾物已獲美國FDA3.1反應時(shí)間對修飾反應的影響批準上市。作者用PEG對研制的 rhIFN-B serl7進(jìn)行取透析后的 rhIFN-B(1.18lmg/ml)3ml,按了化學(xué)修飾優(yōu)化修飾條件,并對修飾物的一般生物50:1的比例加入氰尿酰氯活化的mPEG(CC學(xué)特性進(jìn)行檢定mPEG),25℃振蕩反應。分別于0.5、12、3、4h取出材料與方法0.5ml,用三硝基苯磺酸(TNBS)法(測修飾率。琥珀酸琥珀酰亞胺酯活化的mPEG(SS-mPEG)、對硝1材料基苯碳酸酯活化的mPEG( NPC-mPEG)以相同的方中國煤化工收稿日期:2003-12-15;修回日期:20040202作者簡(jiǎn)介:徐靜(1974),女,碩士,主要從事基因工程產(chǎn)品CNMHG的研究開(kāi)發(fā)工作微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展2004年第32卷第3期法進(jìn)行測定,用三硝基苯磺酸法(TNBS)測定S將pH值調到8.0,以 Sephadex G25為層析介質(zhì),上mPEG的修飾率,茚三酮法測定 NPC-mPEG的修樣后,用pH8.0的20mmo/L的磷酸鹽緩沖液洗脫。飾率52PEG2、PEG3的純化3.2反應溫度對修飾反應的影響將修飾后樣品pH值調到5.5,以 Sephacryl S-取透析后的thIN-B(1.18lmg/ml)3ml,按100為層析介質(zhì),上樣后,用含0.1% SDS pH5.5的20:1的比例加入C-mPEG混勻,分裝于3支試管50mmo/L的醋酸緩沖液洗脫。將 Sephacryl S100中,每管lml,于4℃反應2h4℃反應Ih再25℃反凝膠過(guò)濾后樣品濃縮,調pH值到8.0,以 Sephade應1h25℃反應2h,測定修飾率。 SS-mPEG和NPCC25為層析介質(zhì),上樣后,用pH8.0的20mmo/LPEG以相同的方法進(jìn)行測定的磷酸鹽緩沖液洗脫33溶液pH值對修飾反應的影響6修飾物的一般生物學(xué)特性檢定取透析后 rhIFN-p(1.18lmg/ml)5ml,分別取用TNBS法測定三種修飾物的修飾率。做非還lml置于5支試管中,調節pH值分別為7.0、7.4、原 SDS-PAGE,用 TotalLab1 D Gel analysis vI,0軟件8.0、8.49.2。每支試管分別加入 CC-mPEG6mg,對PEG1膠帶進(jìn)行掃描,分析純度。在 WISH-VSV4℃振蕩反應2h,用5 mol/L NaOH將各樣品pH調系統上按細胞病變抑制法測定hFNβ及其三種修至92,測修飾率。 SS-mPEG和 NPC-mPEG以相同飾物的生物學(xué)效價(jià),用Lowy法測定蛋白含量3),計的方法進(jìn)行測定。算每種樣品的比活性,比較hFNB及其三種修飾34 rhIFN-B濃度對修飾反應的影響物的比活性取0.6ml透析后的hFN-B(8.36mg/ml),按7rhINβ及其三種修飾物溶解度的比較10:1的比例加入CC-mPEG,混勻,立刻倍比稀釋4分別取0.2mg/ml的thFN-β及其三種修飾物次,使溶液中 rhIFN-B濃度分別為8.36mg/ml4.182.5ml,通過(guò) Sephadex G25凝膠過(guò)濾將緩沖液置換mg/ml2.09mg/ml、1.045mg/ml0.523mg/ml,4℃為不含 SDS, PH9.0、20mmo/L的磷酸氫二鈉溶液。振蕩反應2h,測定修飾率。SS-mPEG和 NPC-mPEG取樣進(jìn)行220~100nm紫外可見(jiàn)光譜掃描,將pH以相同的方法進(jìn)行測定。調至7.0,室溫放置過(guò)夜,再進(jìn)行同樣的掃描。同時(shí)3.5反應物摩爾比對修飾反應的影響肉眼觀(guān)察各溶液在不同pH值時(shí)的渾濁度。取透析后的 rhIFN-B(1.18lmg/ml)4m,分別取lm1置于4支試管中分別按5:1、10:1、20:1、結果50:1的比例加人 CC-mPEG,4℃振蕩反應2h,測定1修飾條件對修飾反應的影響修飾率。SS-mPEG和NPC-mPEG以相同的方法進(jìn)1.1反應時(shí)間對修飾反應的影響行測定。三組反應在0.5h時(shí)即有一定的修飾率隨著(zhù)時(shí)4修飾物的制備間的增加,修飾率也隨之增加。雖然2h以后修飾率取透析后 rhIFN-B(5.166mg/ml)l5ml,均分于3仍有增加,但增加幅度不明顯(圖1)。 SDS-PAGE支試管中,分別按5:1、10:12.5:1的比例加入顯示,隨著(zhù)反應時(shí)間的增加修飾物的不均一性增加CC- mPEG,25℃振蕩反應2h,加人30%的冰醋酸終(圖略)。綜合考慮,為此選擇2h作為修飾反應的止反應。制備修飾程度分別為低、中、高的三種修飾時(shí)間。 CC-mPEG的修飾率明顯高于其他兩種PEG物,分別命名為PEG1、PEG2、PEG3。的修飾率,在此條件下 CC-mPEG更適合用來(lái)修飾5修飾物的分離純化ThIFN-B5.1PECI的純化1.2反應溫度對修飾反應的影響以 Sephacryl S200為層析介質(zhì),將修飾后樣品實(shí)驗結果表明,在很溫和的實(shí)驗條件下(4℃或上樣,用50mmoL的醋酸緩沖液洗脫。 SDS-PAGE25℃)修飾反應即可發(fā)生,隨著(zhù)溫度的升高,修飾率分析各組分選擇性地收集以結合單個(gè)PEG分子的會(huì )有所上升,但增加幅度不明顯(圖1)。為了盡可rhIFN-B為主的組分。將樣品濃縮后,再以 Sephacr-能地ylS-100為層析介質(zhì)進(jìn)行凝膠過(guò)濾, SDS-PAGE分析作為中國煤化子影響,故選擇4℃PEG的修飾率明各組分,收集以結合單一分子PEG的 rhIFN-B為主顯高CNMHG說(shuō)明在此條件下的組分。將 Sephacryl S-100凝膠過(guò)濾后樣品濃縮, CC-mPEG更適合用來(lái)修飾hFNB。微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展2004年第32卷第3期1.3溶液pH值對修飾反應的影響隨著(zhù) rhIFN-B蛋白濃度的增加,各組修飾反應pH值越高,反應的修飾率越大(圖1)。但pH值的修飾率有所增加(圖1)?？赡苡捎跐舛鹊脑黾蛹舆^(guò)高,會(huì )影響蛋白質(zhì)的穩定性,考慮到hFNB在大了hFNB分子與PEG分子之間接觸碰撞的機H時(shí)能夠保持穩定,對活性沒(méi)有明顯影響因此選會(huì )但濃度加大的同時(shí)也增加了 rhIFN-B形成多聚擇pH92作為反應體系的pH值。同等條件下體的機會(huì )。為了兼顧兩方面的因素,選擇5mg/mlmPEG的修飾率明顯高于其他兩種PEG的修飾率的蛋白濃度作為修飾反應中 rhIFN-B的最適濃度。明在此條件下 CC- mPEG更適合用來(lái)修飾hIFNβ。同等條件下,C-mPEG的修飾率明顯高于其他兩種1.4rhFN-β濃度對修飾反應的影響PEG的修飾率。40.20.00%Fa820.00%△320Tiee (h)4℃24℃2sTh25℃2h7.488.49.2aperature30.00%25.00%50.00%20.008300010.00%10.000.5231.0452.094.188.Concentration (ag/al)Molar ratio of pEG to rhIFN-B圖1各種修飾條件對修飾反應的影響ig. 1 Effect of react conditions on rate of modification1.5反應物摩爾比對修飾反應的影響隨著(zhù)PEG與 rhIFN-B摩爾比的增加,修飾率9ED顯增加(圖1)。因此,在修飾物的制備過(guò)程中,可以根據對修飾程度的不同需求選擇合適的PEG與hFNB摩爾比。同等條件下, CC-mPEG的修飾率仍明顯高于其他兩種PEG的修飾率2修飾物的純化PEGI經(jīng)過(guò) Sephacryl S200、 Sephacryl S-10020.1kDSephadex G25三步分離純化, SDS-PAGE電泳顯示144kD主要為結合1分子的PEG,電泳掃描顯示純度達9501%;PEG2純化后主要為結合2分子的PEG;純化后的PEG3平均每分子thN結合4分子的圖2rhINβ及其三種修飾物的 SDS-PAGEPEG,見(jiàn)圖2。V凵中國煤化工its three3修飾物的一般生物學(xué)特性檢定測定純化后三種修飾物的修飾率,PEGl為CN MHGLane b, unmodified10.12%、PEG2為22.99%、PEG3為42.47%。rhIFN-B; Lane c: PEGI; Lane d: PEG2; Lane e: PEG3傲生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展2004年第32卷第3期rhIFN-B及其三種修飾物的比活性比較結果見(jiàn)表l。PEG的修飾對 ThIFN-B的活性有影響影響程度與三種修飾物的比活性均有不同程度的下降,分別為修飾程度相關(guān)。修飾前hIFNβ的9536%48.49%、13.30%,說(shuō)明表1thNB及其三種修飾物比活Table 1 Specific activity of rhIFN-B and three modified rhIFN-BConcentrationActivitySampleSpecific activiySpecific activity(IU)(IU/mg)preserving( %rhIFN-B5.13×10°2.33x1PEGI0.21293.56PE30.220.70×100.31×1013.304溶解度比較子PEG時(shí),活性降低不明顯,為修飾前的93.53%。肉眼觀(guān)察, hIFN-B溶液于pH9.0時(shí)澄清透明,說(shuō)明結合一分子的PEG并不會(huì )對hFNB與受體當將pH調到7.0后,溶液渾濁、有顆粒狀物析出。的結合有太大的影響。紫外可見(jiàn)光譜掃描結果顯三種修飾物在pH9.0和pH7.0時(shí)溶液均為澄清透示,單一分子PEG的修飾并未影響芳香族氨基酸在明。掃描結果顯示(圖略),rhFN-β溶液在pH9.0thFN-β結構中的暴露程度,而多分子的PEG修飾時(shí)的掃描結果與規程一致;溶液在pH7.0時(shí)的掃描對芳香族氨基酸的暴露程度有影響,因而改變了結果顯示,hFNB在278m的特征吸收峰消失,大hFNB的光譜學(xué)特性。溶解度研究結果表明,三波長(cháng)時(shí)的吸收明顯增強。三種修飾物在pH9.0和種修飾物在中性pH值時(shí)的溶解度均要高于thFNpH7.0時(shí)的掃描圖譜無(wú)明顯差異。說(shuō)明PEG對β,與文獻報道一致。修飾后hFNB的抗原性體rhIFN-β的修飾增加了其在中性pH時(shí)的溶解度內外穩定性的變化藥物代謝動(dòng)力學(xué)等性質(zhì)正在研討論究中。參考文獻:選擇應用較廣的三種已活化的PEG:CC.(1)cbsL, Godkin DE, Rudick RA,tal. Advances in specificmPEG、Ss-mPEG、NPC-mPEG進(jìn)行研究,最后選擇對therapy for multiple sclerosis[ J]. Curr Opin Neuro 1994, 7(3):hFNB反應性最高的 CC-mPEG對 rhIFNβ進(jìn)行修250254(2) Abuchowski A, McCoy JR, Palczuk NC, et al. Effect of covalent飾。PEG修飾對thINβ有正負兩方面的影響(延attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulat長(cháng)半衰期降低生物活性),為了探討究竟哪一種修ing life of bovine liver catalase [J]. J Biological Chem 1977, 252飾程度更適合對研制長(cháng)效 rhIFN-B的要求,制備三(11):35823586種修飾程度不同的修飾物。選擇凝膠過(guò)濾方法對(3)中國生物制品標準化委員會(huì )編中國生物制品規程200年版PEGl進(jìn)行純化純度分析結果表明,達到了高度純S〕.化學(xué)工業(yè)出版社,672化PEG1的目的。由于對PEG2、PEG3只是探索性[4] Habeeb AFSA. Determination of free amino groups in proteins by研究因而沒(méi)有對它們進(jìn)行高度純化。PEG的修飾對 ThIFN-B的活性有影響,三種修飾物的比活性均5)田溫姚文兵吳梧櫚等,聚乙二醇對干擾素a2b的初步化有不同程度的下降,分別為修飾前 rhIFN-B的修飾研究〔中國藥科大學(xué)學(xué)報2000,31(1):74793.53%48.69%、13.18%。當血FN-B結合一分中國煤化工CNMHG