蛋白類(lèi)藥物聚乙二醇修飾的研究

中國煤炭工業(yè)醫學(xué)雜志2008年2月第1卷第2期文章編號1007-9564(2008)02-0271-04蛋白類(lèi)藥物聚乙二醇修飾的研究400038重慶市,重慶大學(xué)生物工程學(xué)院曠瑜王金霞王伯初程永剛°肖中元”徐波關(guān)鍵詞蛋白類(lèi)藥物;豪乙二醇;化學(xué)修悼物循環(huán)半衰期的延長(cháng)。同時(shí),PEG修飾會(huì )使蛋白活性降低,這種影響大小與修飾劑修飾條件和蛋白本隨著(zhù)蛋白質(zhì)化學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展,用于各身的特點(diǎn)相關(guān)種疾病治療的蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的研制和應用已成為生mPEG的末端羥基是其反應基團,若直接和蛋物醫藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的熱點(diǎn)。蛋白藥物具有作用專(zhuān)白反應,反應條件較為苛刻會(huì )導致蛋白生物活性降高效等優(yōu)點(diǎn)。估計現在蛋白藥物(糖蛋白非糖蛋白低或喪失。為使蛋白能在溫和條件下以較高的速率和抗體)的年增長(cháng)率為10%~35%,然而蛋白作為藥物注射入生物體內時(shí),具有自身的缺點(diǎn):免疫和PEG偶聯(lián)需先將PEG活化,如烷基化或?；?、半衰期短酶解性以及低的溶解度。這些缺點(diǎn)等。使之轉化成活潑酯醛基酰肼等嚴重制約了蛋白類(lèi)藥物的發(fā)展。解決這類(lèi)問(wèn)題的方3mPEG修飾蛋白的種類(lèi)法主要有2:①對氨基酸序列的處理以降低免疫原31mPEG對氨基的修飾選擇氨基作為修飾位性和酶解性;②連接于免疫球蛋白或漿蛋白如清蛋點(diǎn),因為氨基具有親核性且大多存在于蛋白的表白( Albumin);③與藥物載體相結合,以起到對藥物面,最普遍的是賴(lài)氨酸的e-氨基和N末端氨基的保護和緩釋作用;④連接天然或合成的聚合物。常用的mPEG活性酯有:①PEG二氯三嗪衍生物目前對蛋白藥物進(jìn)行化學(xué)修飾是研究的熱點(diǎn),常用( PeG dichlorotriazine);②PEG三氟乙基磺酸酯修飾劑為聚乙二醇( polyethylene glycol,,PEG)及其( PEG tresylate);③PEG琥珀酰亞胺碳酸酯(P衍生物succinimidyl carbonate);④PEG苯丙三唑碳酸酯1聚乙二醇(PEG)簡(jiǎn)介( PEG benzotriazole carbonate);⑤PEG對硝基苯碳聚乙二醇(PEG)是由環(huán)氧乙烷聚合而成其分酸酯(PEGp- nitrophenyl carbonate);⑥PEG三氯子式為HO-(CH2CH2O)-CH2CH2-OH,PEG苯碳酸酯( PEG trichlorophenyl carbonate);⑦PEG通常呈電中性,易溶于水和許多有機溶劑如乙醇、二碳酰咪唑酯( PEG carbonylimidazole);⑧PEG琥珀甲苯丙酮等。PEG的分子量從幾百到幾萬(wàn),選擇酰亞胺琥珀酸酯( PEG succinimidyl succinate),性大用于醫藥的PEG分子量主要介于幾百到它們與蛋白的反應如圖120000之間。分子量超過(guò)1000的PEG通常無(wú)毒,但此類(lèi)反應具有一定缺陷:①二醇分子的存在是FDA批準的可用于藥物、食品和化妝品的粟合②僅局限于低分子量的mPEG1③連接鍵不穩定;④物。直接用PEG修飾時(shí)易發(fā)生交聯(lián)和團聚現象,故副反應較多;⑤選擇性差等。所以修飾結果并不理單甲氧基棗乙二醇( monomethoxy PEG,mPEG)應想。于是有人采用PEG醛來(lái)對蛋白進(jìn)行修飾,例用較多,其分子式為CH3O-(CH2CH2O)CH2CH2-OH,即將PEG一端的活性羥基用甲基如 Kinslter等在對G-CSF、sTNF-RI等進(jìn)行PEG化時(shí),發(fā)現PEG-丙醛在酸性條件下(pH=5)封閉,以減少或避免交聯(lián)或團聚現象2PEG修飾蛋白的原理與a-氨基的偶合具有高的選擇性,這是由于a-氨P(pán)EG與蛋白的非必需基團結合后可作為一種基和其他親核類(lèi)基團相比具有較低的pKa值。親屏障擋住蛋白分子表面的抗原決定簇避免抗體的電類(lèi)PEG衍生物與氨基酸殘基反應時(shí),很大程度上產(chǎn)生或者阻止抗原和抗體的結合而抑制免疫反應的取決于氨基酸殘基的親核性親核反應只有在蛋白產(chǎn)生。蛋白經(jīng)PEG修飾后,分子量增加腎小球過(guò)水中國煤作平基的pa值時(shí)才濾減少,PEG的屏障作用保護了蛋白不易被蛋白酶會(huì )發(fā)物以及PEG羧酸降解同時(shí)減少了抗體的產(chǎn)生,這些均有助于蛋白藥酯也CNMHG專(zhuān)一性,太極集團西南藥業(yè)殷份有限公司272Chinese Journal of Coal Industry Medicine Feb 2008, vol 11. No. 23.2PEG對巰基的修飾蛋白中的巰基主要為半( hydrazone)或與PEG-胺(PEG- amine)反應生胱氨酸殘基所攜帶,由于蛋白表面半胱氨酸殘基數成可逆的Schf堿( Schiff base)1.用硼氫甲腈鈉比賴(lài)氨酸殘基數少得多,所以蛋白中半胱氨酸殘基可將腙還原為更穩定的烷基肼化物,而Scff堿可被是一個(gè)很好的靶位,可以實(shí)現對蛋白的特異性修飾。還原為仲胺。用PEG氨基進(jìn)行還原性烷基化存在常用的PEG修飾劑及反應如圖2。的主要問(wèn)題是,蛋白質(zhì)上的氨基與PEG氨基具有相似的反應活性,就有可能形成交聯(lián)聚集體。此情況下PEG肼化物就更為實(shí)用PEG對蛋白羧基的修飾羧基的修飾位點(diǎn)包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。通常在二環(huán)已基碳二亞胺(DCCI或1-乙基-3-二甲氨基丙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)存在下,羧基可與氨基PEG結合,但同時(shí)也易產(chǎn)生其他的交聯(lián)反應。近年來(lái)發(fā)現PEG-酰肼(PEG- hydrazide)可與羧基特異結合。在EDC存在下,酸性條件(pH4.5~5.0)時(shí),蛋白質(zhì)中氨基被質(zhì)子化而無(wú)交聯(lián)反應的發(fā)生。反應如圖3圖1與氨基反應的PEG衍生物圖3PEG-酰肼對羧基的修飾3.5PEG對蛋白的可逆修飾大多數PEG化化學(xué)的設計是使PEG與蛋白質(zhì)之間形成穩定的連接SH-R鍵10,以利于偶聯(lián)物的純化和長(cháng)期保存。但有時(shí)PEG會(huì )占據或屏蔽蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)而降低其活性。另外,PEG偶聯(lián)物分子量對于蛋白的活性有直接影響,分子量越大則體外活性越低而體內活性越高。最優(yōu)蛋白PEG修飾目標是既要延長(cháng)藥物的半衰期,又不降低藥物的活性。3)mPEG-NHCCHI+SHH-R一種方法是在蛋白和PEG之間采用可降解的CAS-R化學(xué)鍵連接,然后在另外的條件或酶的作用下使+SH-R蛋白從連接物上釋放出來(lái),從而恢復蛋白活性。例如(見(jiàn)圖4)圖2和巰基反應的PEG衍生物及其反應若蛋白中已有的巰基不理想,可采用基因工程手段將半胱氨酸引人到蛋白的特定位點(diǎn),就可以采用對巰基有特異性反應的PEG衍生物對巰基進(jìn)行高選擇性修飾。但通過(guò)這種途徑引入半胱氨酸,會(huì )增加不正確二硫化物和蛋白二聚的幾率山COCH,LCHC-OC3.3PEG對糖類(lèi)殘基的修飾對糖類(lèi)殘基的修飾中國煤化工也是一種定點(diǎn)PEG化的方法,糖類(lèi)經(jīng)過(guò)酶或化CNMHGO學(xué)氧化劑氧化,產(chǎn)生具有反應活性的醛基這些醛基現L人CNH可以和PEG-肼(PEG- hydrazide)反應生成腙圖4蛋白和PEG雙酯的結合與釋放過(guò)程中國煤炭工業(yè)醫學(xué)雜志2008年2月第11卷第2期·273·影響PEG修飾反應的因素聯(lián)分子數增加后,修飾不均一性也會(huì )增加蛋白經(jīng)過(guò)PEG修飾后,性質(zhì)會(huì )有多方面的改47藥物濃度藥物濃度的增加增大了藥物分子變6-11:①免疫原性和抗原性的降低;②循環(huán)半衰和聚乙二醇分子碰撞的機會(huì )能提高反應速率;但濃期的延長(cháng);③溶解性增加;④耐蛋白酶水解;⑤生物度增大的同時(shí)也增加了藥物形成多聚體的機會(huì ),產(chǎn)利用度提高;⑥毒性減小;⑦熱穩定性和機械穩定性物的均一性會(huì )減小。所以必須兼顧二者的平衡增加;⑧等電點(diǎn)、電泳行為以及動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的改變。4.8反應時(shí)間隨著(zhù)時(shí)間的增加,產(chǎn)物的修飾率會(huì )同時(shí),蛋白經(jīng)修飾后,其生物活性會(huì )降低。影響因素增加,但產(chǎn)物的不均一性也會(huì )增加有多種,主要取決于PEG化程度、PEG化位點(diǎn)及修以上因素對PEG修飾的影響對于不同的蛋白飾蛋白構象和電荷的影響等。所以有必要建立有所不同要根據蛋白本身特點(diǎn),同時(shí)考慮修飾后的PEG修飾最優(yōu)方案,以實(shí)現蛋白藥物生物活性的保目的修飾的程度、修飾位點(diǎn)的選擇、產(chǎn)業(yè)化難易程留、一般性能的改善產(chǎn)品毒性減少,反應后產(chǎn)品的度及生產(chǎn)成本等因素,通過(guò)單因子及正交實(shí)驗確定高回收率等。最優(yōu)方案篩選應考慮如下因素:最優(yōu)反應工藝。4.1修飾劑的選擇修飾劑的選擇應綜合考慮修5結語(yǔ)飾劑的水解穩定性及反應活性、修飾劑與蛋白質(zhì)氨M.J. Roberts等10提出PEG修飾的分代學(xué),基酸殘基之間反應專(zhuān)一性、修飾位點(diǎn)、修飾劑與蛋白第一代PEG技術(shù)主要限定于小分子量PEG,因為質(zhì)連接鍵的穩定性毒性、抗原性、修飾后是否需要在高分子量mPEG中含有大量二醇(聚合過(guò)程中水進(jìn)一步分離是否適于建立快速方便的分析方法修的存在所引起)。高二醇含量會(huì )引起很多的問(wèn)題如飾劑是否能夠簡(jiǎn)便快速地合成或購買(mǎi)等因素2交聯(lián)現象。另外,第一代PEG技術(shù)中低分子量4.2修飾反應的pH值pH值是PEG修飾蛋白PEG修飾沒(méi)有選擇性,也是由于小分子量PEG有的一個(gè)重要的因素因為它決定了具有潛在反應能更多的機會(huì )刺穿蛋白分子的表面,從而引起較多位力的功能基所處的可反應和不可反應的離子狀態(tài),點(diǎn)的結合。而第二代的PEG化技術(shù)避免了第一代般情況下,增加pH可以提高反應速率,降低pH技術(shù)的缺點(diǎn),多采用高分子量PEG活性酯,同時(shí)改值會(huì )減小反應速率。同時(shí)控制合適的pH值可以對進(jìn)了生產(chǎn)工藝,降低了PEG中二醇的含量,其應用蛋白中氨基酸殘基進(jìn)行特異性修飾,使修飾專(zhuān)一性越來(lái)越廣泛,1提高,從而提高收得率降低分離難度,減少生產(chǎn)成經(jīng)過(guò)PEG修飾的藥物蛋白不僅較高地維持了原藥的生物活性,而且能夠有效地降低或消除其免4.3藥物與PEG的摩爾比通常情況下,隨著(zhù)疫原性和毒性。同時(shí),由于分子量和交聯(lián)度的增加PEG和蛋白的摩爾比增加,修飾蛋白的相對分子質(zhì)修飾后的藥物蛋白的循環(huán)半衰期顯著(zhù)延長(cháng)。從而顯量也會(huì )增加蛋白的修飾率會(huì )提高,但修飾的不均一示了藥物蛋白PEG修飾技術(shù)的良好應用前景。度也會(huì )增加生物活性保留會(huì )下降故必須控制合適6參考文獻的比例,使蛋白修飾率最高,同時(shí)也盡可能保留蛋白[1]姜忠義許松偉,王艷強蛋白質(zhì)和肽類(lèi)分子的聚乙的生物活性。二醇化化學(xué)[J].有機化學(xué),2003,23(12):13404.4反應溫度蛋白藥物對溫度的穩定性較差,要1347使蛋白藥物修飾后仍然保留高的生物活性,反應必[2] K. Rajender Reddy MD, Marlence W Modi PhD,Si-須在蛋白的耐受溫度下進(jìn)行。而同時(shí)溫度也決定反mon Pedder PhD. Use of peginterferon alfa-2a(40應速率,影響修飾的均一性。對于巰基的修飾來(lái)說(shuō),KD)(Pegasys) for the treatment of hepatitis C[J]溫度可以影響到活性巰基的微環(huán)境,仔細選擇溫度Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54: 571可以降低活性,防止一些競爭基團的反應。[3] Yu-Sen Wang, Stephen Youngster, Micheal Grace4.5PEG分子量增加PEG的分子量可以延長(cháng)et al. Structural and biological characterization of pe-藥物的半衰期。而且支鏈的PEG比直鏈的更具有優(yōu)勢,因為支鏈的PEG可以減緩在腎小球中的濾中國煤化工lanced Drug DeliveryCNMHG4.6偶聯(lián)的PEG分子數增加偶聯(lián)的分子數等于FM, Morpurgo M. Bioconjugation in phar增加PEG的分子量,因而也會(huì )延長(cháng)半衰期。但是偶maceutical chemistry[J]. Inter J Pharmaco, 1999. 54·274Chinese Journal of Coal Industry Medicine Feb 2008, Vol 11, No. 2and Biological application[A]. Acs symposi[5] Zalipsky S Chemistry of poly (ethylene glycoL)con-Series No680[C]. Washington, DC, Amerricanjugates with biologically active molecules [J]. AdvChemical Society, 1997Drug deliv Rev. 1995. 16. 157[14] M. J. Roberts, M. 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Poly(ethylene glycol)Chem-文章編號1007-9564(2008)02-0274-02完全腹腔鏡下右肝癌切除2例363000福建省漳州市,福建醫科大學(xué)附屬津州市醫院普外一科李建國韓明瑞陳德烽李輝林志川關(guān)鍵調肝癌;腹腔鏡;外科手術(shù)塊,AFP>1000ng/L,乙肝小三陽(yáng),肝功能ChdA級。胃鏡提示:十二指腸球部潰瘍(S1期)1資料與方法1.2手術(shù)器械腹腔鏡(美國史賽克)超聲止血刀11病例資料例1,男,57歲,主訴右上腹悶痛(美國強生公司制造)腹腔鏡彭氏多功能刮吸器2個(gè)月于2006年3月15日人院。彩超提示:右肝1.3手術(shù)方法全麻下,腹腔壓力14mmHg臍下前葉4.3cm×3.9cm×3.7cm腫塊;MR:左肝內葉建立觀(guān)察孔,置人10mm30度鏡,劍突下建立主操4.3cm×4.4cm×4.5cm,AFP>1000ng/L,乙肝作孔,右助下及右腋前線(xiàn)平臍建立輔助孔。無(wú)肝門(mén)小三陽(yáng),肝功能 Child A級。胃鏡提示:慢性淺表性阻斷采用超聲刀及彭氏多功能刮吸器交替使用切胃炎。肝法,中國煤化工面止血后用生例2男,54歲,主訴右上腹疼痛于2006年6月物蛋CNMH右肋下操作孔29日入院。彩超提示:右肝3.0cm×3.2cm×3.0擴大后取出,常規量雙套管沖洗引流。cm腫塊CT:左肝內葉3.0cmx2.6cm×3.0cm腫2結果