乙醇脫氫酶法測定血漿中乙醇

西北國防醫學(xué)雜志( Med NDFNC)2005Oct.26(5)345論著(zhù)乙醇脫氫酶法測定血漿中乙醇伏建峰史清海路西春高華丁艷萍(蘭州軍區烏魯木齊總醫院新疆烏魯木齊830000)摘要目的建立一種快速測定血漿中乙醇濃度的新方法。方法選用三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸Tris-hcl)作為緩沖體系在堿性條件下乙醇脫氫酶(ADH)催化乙醇轉化成乙醛同時(shí)生成還原型輔酶I(NADH)在340nm波長(cháng)處檢測吸光度的變化對照標準計算乙醇的濃度。結果ADH最適用量為753KU/L輔酶(NAD+)最適濃度為60.0 mmol檢測過(guò)程僅需90s線(xiàn)性范圍可達0~68.60mmol/L變異系數(CV)為2.31%~3.25%回收率為98.4%~101%與美國DADE試劑盒比較具有良好的相關(guān)y=0.985y=0.987x0.024。結論本法測定血漿中乙醇無(wú)需除蛋白具有快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)可用于自動(dòng)生化分析儀及手工操作適于臨床常規運用。關(guān)鍵詞:實(shí)驗室診斷;乙醇;乙醇脫氫酶;檢測;臨床應用中圖分類(lèi)號:R446.1文獻標識碼:A文章編號1007-8622(200505-0345-03 Determination of alcohol in plasma by alcohol dehydrogenase method FU Jian--feng, SHI Qing-hai,luxi-cun,etal.( Urumchi General Hospital of Lanzhou Command,pla80000, China) Abstract :Objective To establish a new method for rapid measuring alcohol( ALC)in plasma. Methods: Tri( hydroxymethyl)aminomethane-hydrochloride-(tris-hcl) buffer was used in this study. In the condition of alkalescence alcohol dehydrogenase( ADH )catalyzed the oxidation of ALC to acetaldehyde with the simultaneous production of deoxidized nicotinamide adenine dinucleotide( NADH ) The variance of absorbance was determined by a filter of 340 nm. The concentration of ALC was calculated according to the standard. Results The most adapt quantity of ADH was 753 KU/L and the best concentration of the NAD* was 60. 0 mmol/L. It cost only 90 s in the whole reaction. The range of linearity was from zero to 68. 60mmol/L. The coefficient of variation (CV)in different concentrations was from 2. 31% to 3. 25%. The recovery rate ranged from 98.4% to 101%. Compared with DADE America) reagents method, the regression equation was obtained. Conclusion: This ADH method for measuring the concentration of ALC in plasma is rapid and simple without removing protein. It could be used both automatically and manually and suitable for clinical application. Key wordsLaboratory diagnosis; Alcohol; Alcohol dehydrogenase; Testing; Clinical application飲酒過(guò)量可引起以神經(jīng)精神癥狀為主的疾病,整個(gè)檢測過(guò)程僅需90s可用于自動(dòng)生化分析儀及稱(chēng)為酒精中毒(alcohol poisoning)或乙醇中毒(etha手工操作適于臨床常規運用 nol poisoning一次飲用大量酒類(lèi)飲料會(huì )對中樞1原理神經(jīng)系統產(chǎn)生先興奮后抑制作用重度中毒可使呼選用三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-hl)吸心跳抑制而死亡鑒于酒精中毒的后果嚴重所作為緩沖體系在堿性條件下,乙醇脫氫酶(ADH)以迅速測定血漿中乙醇濃度對早期診斷和處理急催化乙醇轉化成乙醛,同時(shí)生成還原型輔酶性酒精中毒具有非常重要的臨床價(jià)值。作者報道一(NADH)。在340nm波長(cháng)處檢測吸光度的變化對種新的酶終點(diǎn)法測定血漿中乙醇濃度,無(wú)需除蛋白,照標準計算乙醇的濃度。2材料與方法收稿期2005-06-23346西北國防醫學(xué)雜志( Med NDFNC)2005Oct.26(5)ADH16.8mg溶于10ml重蒸水試劑Ⅱnd8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0的Tris-Hcl溶238.8mg溶于6ml重蒸水試劑ⅢTris1070g液結果顯示pH10.5時(shí)較為適宜同時(shí)確定Tris濃溶于100ml重蒸水檢測前與0.1mol/LHL按5度為882.9mmol/L:1(V/V)混合。3.5反應動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn):選擇低、中、高(17.152.2標準液分別加入100、200、300和4001無(wú)34.30、68.6mmol/L)三個(gè)不同濃度標準血漿用本水乙醇到50ml蒸餾水中制備出的標準液濃度分法在XL上觀(guān)察反應進(jìn)程圖2結果表明不同濃度別為17.15、34.30、51.45和68.60mmol/L儲存于的樣品60s內吸光度上升最快70~80s曲線(xiàn)平緩,具塞容器中備用。90s后吸光度基本一致因此選擇90s為反應終點(diǎn)2.3混合血漿制備采集40位健康體檢者肘部靜時(shí)間。脈血各2 ml NaF抗凝離心后制備混合血漿。2.4標準血漿分別加入20、40、60、80μ1無(wú)水乙醇到10ml混合血漿中混勻制備出的標準血漿濃度分別為17.15、34.30、51.45和68.60mmol/L,以1ml分裝,-20℃儲存備用。2.5儀器:XL型生化分析儀(美國杜邦)2.6自動(dòng)分析參數:反應類(lèi)型終點(diǎn)法反應溫度:37℃波長(cháng)340mm(主)380nm(次)樣品3μl試01003040507081100劑125μl、試劑Ⅱ130ul、試劑Ⅱ340μ反應時(shí)圖2ADH法檢測三個(gè)不同乙醇濃度標準血漿反應進(jìn)程曲線(xiàn)間90s3實(shí)驗與結果3.6線(xiàn)性范圍取濃度為0、17.15、34.30、51.45、3.1ADH用量的選擇取ADH(單位KU/L)活性68.60mmol/L的標準血漿用本法測定,乙醇在0~分別為:27、54、108、215、323、430、538、645、75368.60mmolL范圍內線(xiàn)性良好860、968的酶工作液分別測定高濃度(51.45mmol/3.7精密度試驗選擇低中、高(17.15、34.30、L)的乙醇標準液圖1結果表明,ADH用量在75351.45mmol/L)三個(gè)不同濃度標準血漿用本法重KU/L以上最適。復測定20次批內變異系數分別為3.25%、2.31%和2.40%。3.8回收試驗在已知乙醇濃度為20.0mmol/L的標本內分別加入低、中、高三種濃度(17.15、34.30、51.45mmol/L)的乙醇標準液,回收率分別為100%、101%及98.4%3.9干擾試驗:將同體積蒸餾水和同體積不同濃度的干擾物分別加入到等體積的混合血漿中前者為對照樣品其余為含不同濃度干擾物質(zhì)的檢測樣0102003004005006007008000010圖1ADH用量的選擇/L品每個(gè)樣品重復測定5次取均值。檢測樣品與對照樣品比較,偏差<±5%說(shuō)明該濃度物質(zhì)對檢測3.2NA濃度選擇在pH10.5、adH為753KU/L無(wú)顯著(zhù)干擾。測定結果顯示本法至少能去除30條件下觀(guān)察NAD+濃度(mmol/L)為10、20、3040、mmol/L的乙醛。此外膽紅素<500umol/L血紅50、60、70、80、90時(shí)對反應進(jìn)程的影響NA+最適蛋白<5g/L、甘油三脂<100mmol/L時(shí)測定結果濃度為60.0mmol/L未見(jiàn)明顯干擾。3.3緩沖體系的選擇配制pH9~11的各種緩沖3.10對比試驗選取40份不同乙醇含量的血漿分液甘氨酸-NaOH、h2O4-k2hpO4、naCO3-別用本法與美國DADE試劑盒對比測定結果經(jīng)回 NaHCO3和Tris-cl等在相同條件下觀(guān)察其對歸分析y=0.985y=0.987x+0.024世租的影響TⅡ1為官111廣市仕tT通慣者0西北國防醫學(xué)雜志( Med NDFNC)2005Oct.26(5)347mmol/36例0.5~1.5mmol/L4例交通管理部門(mén)下ADH的最適pH值為10.5送檢疑有酒后駕車(chē)者27例,血漿乙醇濃度在10.8乙醛是乙醇的氧化產(chǎn)物,其產(chǎn)量增多可抑制~39.0mmol/L平均為21.4mmol/L其中24人最ADH的活性,試驗中當乙醛濃度達30.0mmol/L終承認飲過(guò)酒酒后反應遲鈍并嘔吐者8例血漿乙時(shí)仍未見(jiàn)其對ADH有明顯的抑制作用推測可能醇濃度為20.5~39.7mmol/L酒后昏迷者3例血是Tris-Hcl和乙醛結合生成一種復合物且此反應漿乙醇濃度分別為55.2、59.1和62.8mmol/L不可逆使乙醛迅速被移走反應得以快速進(jìn)行。4討論酶法自動(dòng)分析已經(jīng)普及血中乙醇的酶學(xué)測定ADH法檢測乙醇最早由 Hadjiioanno提出并沿法分為兩種乙醇氧化酶法和ADH法。乙醇氧化酶用至今,傳統方法需除蛋白,且反應時(shí)間較長(cháng)(約法的試劑組成簡(jiǎn)單缺點(diǎn)是特異性差甲醇對測定干300s)由于乙醇極易揮發(fā)很難確保其檢測的準確擾很大可出現假陽(yáng)性。DH法相對特異受甲醇性。本法選擇TrisCL作為緩沖體系加之選用或異丙醇的干擾極小5】此外ADH較乙醇氧化酶高活力的ADH促使樣品中有限的乙醇快速轉化成更易得到且成本較低因此ADH法更適宜常規操乙醛整個(gè)檢測過(guò)程僅需90s且不用除蛋白經(jīng)方作易于推廣應用法學(xué)評價(jià)各項指標均較為滿(mǎn)意線(xiàn)性范圍可達0參考文獻:68.60mmol/L變異系數(CV)為2.31%~3.5%,[1] Bishop ML, DubenEngelkirk JL, Fody EP. Clinical回收率為98.4%~101%,與美國DADE試劑盒比 chemistry[m]. Fourth Edition, Philadelphia USALippin較具有良好的相關(guān)。 cott Williams Wilkins, 2000.508-610.ADH工作環(huán)境為堿性,甘氨酸-NaOH、[2]建強劉鳳蘭血清乙醇脫氫酶活性測定及其臨床應用J]天津醫科大學(xué)學(xué)報200171)110-111H2PO4-k2HO4、a2CO3- NaHCO33和Tris-cl[3]陳金來(lái),劉毅,郭妹等酶法血清乙醇測定試劑盒等緩沖體系均可選用。在我們的實(shí)驗中甘氨酸-的初步評價(jià)及臨床意義J]天津醫科大學(xué)學(xué)報20028NaOH、KH2PO4-K2HPO4緩沖體系不甚理想(4)506-508.Na2CO3-NaHCO33和Tris-hcl緩沖體系較為理想,[4 Kubota, Hosoki et al. Complete amino acid由于Na2CO3- NaHCO3緩沖液容易結晶不利于存 sequence and characterization of the reaction mechanism of儲作者選擇Tris-hcl作為緩沖體系,該緩沖體系 glucosamine-induced- novel alcohol dehydrogenase from含有兩性離子有利于發(fā)揮酶的活力。不同文獻報 Agrobacterium radiobacter( tumefaciens)j] Arch Bio-道的ADH的最適pH值也有很大差別范圍大致為 chem Biophys,2002,398(2)203-2128.8~10.2-41可能由試驗條件及ADH的來(lái)源不5]張紅霞鄧振華謝娜等酒后駕車(chē)血液呼氣中乙醇同所致作者所選用ADH來(lái)自酵母在本試驗條件檢測方法評價(jià)J]刑事技術(shù)2003536-39《西北國防醫學(xué)雜志》征訂啟事《西北國防醫學(xué)雜志》為蘭州軍區聯(lián)勤部衛生部主辦的國、內外公開(kāi)發(fā)行的綜合性醫藥衛生學(xué)術(shù)性期刊是中國科技論文統計源期刊已被《中國科學(xué)引文數據庫》等國內重要數據庫收錄也被美國化學(xué)文摘(CA)和俄羅斯文摘雜志(JA)收錄,刊出省部級以上各類(lèi)基金資助論文及獲獎?wù)撐恼加休^高比例多次在軍內外期刊質(zhì)量評比中獲獎本刊刊登軍內外醫務(wù)工作者有關(guān)基礎醫學(xué)、臨床醫學(xué)、軍事醫學(xué)、文獻綜述、講座、護理、衛生科技管理等方面的學(xué)術(shù)文章。主要欄目有述評論著(zhù)、臨床研究、高原醫學(xué)、經(jīng)驗交流、護理、綜述、講座衛生行政等。我們希望本刊能對廣大醫務(wù)工作者有所神益并熱切歡迎對我刊給予扶持和指導?！段鞅眹泪t學(xué)雜志X前身為《蘭后衛生》)1979年創(chuàng )刊2002年改為雙月刊大16開(kāi)本80頁(yè)逢雙月末出版,每期定價(jià)10.00元?！段鞅眹泪t學(xué)雜志》國內郵發(fā)代號54101歡迎在當地郵局訂閱也可直接向編輯部訂閱全年70.00元含郵費)編輯部地址蘭州市小西湖西街98號郵政編碼730050聯(lián)系遷(0010750