固定化酵母連續發(fā)酵乳清粉生產(chǎn)燃料乙醇的研究

釀酒科技2010年第2期(總第188期) LIQUOR- MAKING SCIENCE& TECHNOLOGY2010No2(Tol18固定化酵母迕續發(fā)酵乳清粉生產(chǎn)燃料乙醇的研究郭學(xué)武,周珺,劉森,肖冬光(工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗室,天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗室,天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津30022)對混合固定化克魯維酵母和固定化釀酒酵母連續發(fā)酵乳清生產(chǎn)燃料乙醇進(jìn)行了研究。結果表明,對比雙柱式連續發(fā)酵,混合菌株單柱式連續發(fā)酵工藝較姸,發(fā)酵周期縮短為36h,酒精度達到了4.7%vol。關(guān)鍵詞:燃料乙醇;固定化;酵母;乳清粉中圖分類(lèi)號:Q814;TS2611;TS2622;TS2614文獻標識碼:A文章編號:1001-9286(2010)02-0020-03Research on Continuous fermentation of whey powder by ImmobilizedKluyveromyces marxianus and saccharomyces cerevisiaeto produce fuel ethanolGUO Xue-wu, ZHOU Jun, LIU Miao and XIAO Dong-guang(Key Lab of Industrial Microbiology of Ministry of Education, Tianjin Industrial Microbiology Key Lab,College of Biotechnology of Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300222, China)Abstract: Continuous fermentation of cheese whey powder (CWP)by immobilized Kluyveromyces marxianus and Saccharomyces cerevisiae toproduce fuel ethanol was studied. The results showed that single-column continuous fermentation by mixed strains was better than double-columncontinuous fermentation(it could shorten fermentation period to 36 h and alcolicity could reach up to 4.7 %vol ).Key words: fuel ethanol; immobilized; yeast; whey powder乳清是乳制品企業(yè)利用牛奶生產(chǎn)干酪時(shí)所得的一種1.12試劑天然副產(chǎn)品,其主要成分有乳糖乳清蛋白、礦物質(zhì)等,具乳清粉:地球牌甜乳清粉,天津奧凱化工貿易有限公有很高的營(yíng)養價(jià)值。近年來(lái),關(guān)于如何利用乳清的問(wèn)題一司;海藻酸鈉:上?；瘜W(xué)試劑廠(chǎng);氯化鈣:天津市凱通化學(xué)直是研究的重點(diǎn)。目前已經(jīng)有一些關(guān)于利用乳清生產(chǎn)乙試劑有限公司。醇、單細胞蛋白、沼氣等的研究報道1.2種子培養基但是,利用乳清生產(chǎn)乙醇存在乙醇得率低(2%volYEPD;發(fā)酵培養基:乳清粉水溶液:乳清粉12%3%vl)、分離成本高等問(wèn)題。乳清粉是乳清濃縮干燥(wv),pH6.0,于110℃,20min滅菌。初始糖濃度為的產(chǎn)物,其相比乳清來(lái)說(shuō)具有營(yíng)養物質(zhì)濃度高、可長(cháng)期100g穩定放置等優(yōu)點(diǎn),是一種較好的替代乳清生產(chǎn)乙醇的1.3酵母細胞的固定化方法原料S。筆者已經(jīng)報道過(guò)關(guān)于固定化酵母發(fā)酵乳清的研參考文獻[6],并根據各試驗需要,選擇各自所需細究,本文進(jìn)一步對固定化酵母連續發(fā)酵乳清粉生產(chǎn)乙胞濃度。醇進(jìn)行研究,現將結果報道如下。4酵母細胞的增殖培養1材料與方法將制備好的固定化酵母凝膠顆粒接入到YEPD中30℃活化24h。1.1材料1.5實(shí)驗方法1.L.1菌種固定化細胞發(fā)酵:將獲得的固定化酵母菌液體種子馬克思克魯維酵母( Kluyveromyces marxianus)TY-接入發(fā)酵培養基中,30℃、120rmin,進(jìn)行固定化細胞發(fā)13釀酒酵母( accharomyces cerevisiae)AY-5均為本室酵,并根據各試驗需要,選擇各自所需固定化細胞的濃保存。度中國煤化工基金項目:天津市應用基礎及前沿技術(shù)研究計劃重點(diǎn)項目(09 JCZDJC17900),天03),2009-2010學(xué)年天津科技大學(xué)實(shí)驗室開(kāi)放基金項目資助。CNMHG收稿日期:2009-12-15作者簡(jiǎn)介:郭學(xué)武(1980-),男湖南人,助理研究員,研究方向:現代釀造技術(shù)通訊作者:肖冬光(1956),教授、博士生導師xdg@tust.edu.cn郭學(xué)武,周珺,劉森,肖冬光·固定化酵母連續發(fā)酵乳清粉生產(chǎn)燃料乙醇的研究單柱連續發(fā)酵:見(jiàn)圖1。首先將發(fā)酵液填滿(mǎn)發(fā)酵柱,通過(guò)改變恒流泵的轉速改變向柱式反應器內加入并按10%接種量接人增殖好的固定化酵母顆粒,并且通發(fā)酵液的流量,最終改變發(fā)酵稀釋速率,進(jìn)行固定化酵過(guò)恒流泵使柱體內的發(fā)酵液按22mI/min的速度進(jìn)行循母細胞發(fā)酵實(shí)驗,確定最佳稀釋率。首先,先將發(fā)酵液填環(huán),以提高發(fā)酵速度。發(fā)酵一定時(shí)間后,當殘糖含量降低滿(mǎn)柱式反應器,并接入酵母凝膠顆粒,先反應一定時(shí)間,至2g10mL后,開(kāi)始以15mLh的流量(即稀釋率為當流出的反應液的殘糖含量由初始的l0g/100mL降低0025h)向柱式反應器注入新鮮發(fā)酵液,通過(guò)固定化酵至2g100mL時(shí),開(kāi)始將發(fā)酵液以不同的流量流人柱式母細胞層進(jìn)行連續發(fā)酵。并且每隔4~12h不等的時(shí)間反應器,待反應穩定后測定其酒精度及殘糖值。恒流泵轉段對流出的發(fā)酵醪液中的殘糖含量、酒精度、PH值和細速與稀釋率換算見(jiàn)表1,不同稀釋率對殘糖含量和酒精胞泄漏數進(jìn)行測定。度的影響見(jiàn)圖3。表1轉速與稀釋率對照結果恒流泵轉速進(jìn)料速度稀釋率平均停留時(shí)間(r/min)(h)0150.8150.02540b0. 5r/min-lr/min-0. 8r/min1.5r/min注:1發(fā)酵液,2.恒流泵,3反應柱,4進(jìn)料口,5循環(huán)液進(jìn)料口,6.出料口,7循環(huán)液出料口圖1單柱式連續發(fā)酵示意圖雙柱串聯(lián)連續發(fā)酵:如圖2所示,首先將發(fā)酵液填滿(mǎn)A發(fā)酵柱,并按10%接種量接入TY-13酵母顆粒,并且通過(guò)恒流泵使柱體內的發(fā)酵液進(jìn)行循環(huán),發(fā)酵3h后,也681224由恒流泵作用使A發(fā)酵柱內的發(fā)酵液流入已按10%接時(shí)間(h)種量裝填好AY-5酵母顆粒的B發(fā)酵柱。當流出液的殘a不同稀釋率對殘糖含量的影響糖含量降低至2g/100mL后,開(kāi)始以15mLh的流量向A柱式反應器注人新鮮發(fā)酵液,通過(guò)固定化酵母細胞層2.5進(jìn)行連續發(fā)酵。并每隔4~12h不等的時(shí)間段對流出的發(fā)酵醪液中的殘糖含量、酒精度、pH值和細胞泄漏數進(jìn)行測定。0.50.8轉速(r/min)圖b不同稀釋率對酒精度的影響圖3不同稀釋率對殘糖含量和酒精度的影響網(wǎng)圖3a、圖3b可知,稀釋速率為0025h為佳,此注:L發(fā)醇液2恒流泵,3反應柱,4進(jìn)料口,5取樣口,6最終發(fā)酵時(shí)生成的酒精度較高,且發(fā)酵修液中線(xiàn)糖含量較低,反應液出料口,7出料口器的生產(chǎn)能力也達到一定水平。若將稀釋率降低為圖2雙柱式連續發(fā)酵示意圖0015h,酒精度與殘糖含量均比稀釋率為0.025h時(shí)較優(yōu),但優(yōu)勢并不明顯,且平均停留時(shí)間明顯延長(cháng),故最終1.6檢測方法選擇稀釋率為0.025h為宜?？偺堑臏y定采用菲林滴定法,乙醇釆用快速氧化22中國煤化工法測定。確定2結果與分析CNMHG,由于發(fā)酵液體積僅為600mL,且固定化顆粒密度較髙,易于沉入發(fā)酵液的下21連續發(fā)酵稀釋率的確定層,使得發(fā)酵液與固定化細胞接觸面積較小,因此,為防釀酒科技2010年第2期(總第188期)· LIQUOR- MAKING SCIENCE& TECHNOLOGY2010No2Toll8表2不同循環(huán)速度對殘糖含量和酒精度的影響對較低,酒精度也達到相應水平。轉速發(fā)酵時(shí)間(h酒精含量2.3固定化雙柱串聯(lián)連續發(fā)酵(r/min)4812243648607296120(%vo)207.86.44.63.22.2般釀酒酵母不能直接利用乳糖需要由克魯維酵母首先將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖后才能60684.82.90.90.690.480.40.42.441.447利用。由于混菌固定化酵母單柱式發(fā)酵,雖然能提806.64.72.70.850.650.460.410.40.40.44.8供發(fā)酵液的循環(huán)流動(dòng),但還不能保證兩種酵母的接1006.54.82.60.820.660.470.40.390.380.394.8種時(shí)間間隔,因此,還需要再對連續發(fā)酵的模式進(jìn)行探討,以確定最佳的連續發(fā)酵的模式。參照15止發(fā)酵液發(fā)酵不完全,故通過(guò)恒流泵的蠕動(dòng)使發(fā)酵液可的實(shí)驗方法,對固定化雙柱串聯(lián)連續發(fā)酵進(jìn)行了研究,實(shí)以循環(huán)流動(dòng),以提高發(fā)酵效率。恒流泵分別通過(guò)20驗結果見(jiàn)圖4、圖4b。r/min、40rmin、60r/min,80rmin和100rmin5個(gè)不同的轉速提供發(fā)酵液的循環(huán)流動(dòng)。乳清還原液按上述實(shí)驗3.5r+殘糖含量→灑精度3內容確定以15mLh的速度向柱式反應器中流加,實(shí)驗結果見(jiàn)表2。恒流泵轉速與發(fā)酵液循環(huán)速度對照結果見(jiàn)表3。1.5表3轉速與循環(huán)速度對照結果0.5恒流泵轉速(r/in)循環(huán)速度(aL/uin02468243640486072961204015a固定化雙柱串聯(lián)連續發(fā)酵對殘糖含量和酒精度的影響52[D值變化組胞神高數1204.820E+6由表3所知,恒流泵轉速在60~-100r/min時(shí)對酒精1.5E+06生成量和殘糖值影響均不大。因此,綜合考慮殘糖含量、●·1.0E+06酒精度以及節約能源方面的因素,最終確定恒流泵的轉5.0E+05合d速以60r/min為最佳。02468243640486072961202.2.2混菌固定化酵母單柱式連續發(fā)酵時(shí)間(h)通過(guò)2.1.1和2.12.1確定的稀釋率和循環(huán)速度,用b固定化雙柱串聯(lián)連續發(fā)酵對pH值和細胞泄漏的影響15的實(shí)驗方法,對混菌固定化酵母單柱式連續發(fā)酵實(shí)驗圖4分別固定化雙柱串聯(lián)連續發(fā)酵結果進(jìn)行了研究,結果見(jiàn)表4。表4混菌單柱式連續發(fā)酵結果由圖4的結果分析可知,分別固定化雙柱串聯(lián)連續時(shí)間殘糖含量酒精度細胞泄漏數發(fā)酵實(shí)驗的平均停留時(shí)間為40h,pH值的變化幅度不大(個(gè)/mL)且從24h開(kāi)始一直比較穩定,說(shuō)明發(fā)酵進(jìn)人穩態(tài)后發(fā)酵0.05.02.1×105液的酸堿性環(huán)境沒(méi)有太大變化,且對發(fā)酵效果影響不大。5.345.02.7X105最終發(fā)酵醪液中的殘糖含量為0.88g/100mL,而酒精生4.761.24.83.5×1051.44.73.9×105成量為40%vol。這種連續發(fā)酵模式雖然可以保證兩種81,84.64.0×105酵母接種的時(shí)間間隔,但不能提供發(fā)酵液的循環(huán)流動(dòng),導3.44.54.5×105致還有部分糖發(fā)酵不完全,使最終的實(shí)驗結果明顯不如0.684.74.36.8×105混菌固定化酵母單柱式連續發(fā)酵效果好,因此可以說(shuō)明,4.888×105增加發(fā)酵液的循環(huán)流動(dòng)對混菌固定化酵母連續發(fā)酵來(lái)說(shuō)480.484.84.3604.7003.1×10比較重要,既能使發(fā)酵液多次重復接觸固定化酵母層,還0.4437X10°可以增加一定的氧氣供給,對提高發(fā)酵速度以及發(fā)酵液中的酒精度有一定幫助。由表4中所列出的各項實(shí)驗指標數值可看出,混菌3單柱式連續發(fā)酵實(shí)驗提高了發(fā)酵速度,平均停留時(shí)間為中國煤化工36h。pH值變化幅度不大,且從36h開(kāi)始一直比較穩定,CNMHG002b為最適稀釋說(shuō)明發(fā)酵進(jìn)入穩態(tài)后,發(fā)酵液的酸堿性環(huán)境沒(méi)有太大變度。刈比告回正化圈休單杜連續發(fā)酵和雙柱式連續化,且對發(fā)酵效果影響不大。發(fā)酵醪液中的殘糖含量也相發(fā)酵工藝確定了單柱式連續發(fā)酵工藝較好其發(fā)酵周期(下轉第26頁(yè))釀酒科技2010年第2期(總第188期)· LIQUOR- MAKING SCIENCE& TECHNOLOGY2010No.2(Tol18一0.05%-0.20%1.00%響來(lái)看,各個(gè)因子影響燃料乙醇濃度的順序分別1+01000人A1=A2>A3、Bl>B2>B3、C2=C3>ClD3>D2>D因此可以確定最佳條件組合為ABCD3、ABCD3A2BCD3、ABCD3,即時(shí)間為12h或24h、溫度32℃pH40或4.5、接種量12%。③從各因子的極差大小RD>RB>RA=RC可知在發(fā)酵條件中,對乙醇濃度影響最大的是酵母用量,其次是溫度,而時(shí)間和pH的影響是最小的。3結論時(shí)間(h)圖5 Tween-80對水稻秸稈同步糖化發(fā)酵的影響水稻秸稈同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的適宜的發(fā)酵工藝條件為起始pH值為40~45,培養溫度為32℃,優(yōu)化組合試驗對發(fā)酵條件中的時(shí)間溫度pH值和接種接種量為12%,發(fā)酵時(shí)間12~24h在此條件下,生成乙量等4個(gè)因素進(jìn)行了正交試驗,試驗設計及試驗結果見(jiàn)醇的濃度為14mgmL,水稻秸稈原料的乙醇轉化率為表1。7.02%。表1L(3)正交實(shí)驗結果及分析實(shí)驗號因素乙醇濃度參考文獻:A(時(shí)間,b)B(溫度,℃)C(p)D(接種量%)(mg/毗L)[]徐昶,龍敏南,鄔小兵,等高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條1(12)1(32)1(3.5)1(8)l.1件研究[廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2005,44(1):10721(12)2(37)2(4.0)2(10)1.3[2] Ghose T K Measurement of cellulase activities). Pure Appl31(12)3(40)3(4.5)3(12)1.3Chem,1987,59(2):257-268.1(32)2(4.0)(24)2(37)3(4.5)1.13]李華,高麗β-葡萄糖苷酶活性測定方法的研究進(jìn)展食品62(24)與生物技術(shù)學(xué)報2007,26(2):107-11473(36)1(32)3(4.5)2(10)13高培基曲音波,王祖農纖維素酶解過(guò)程的分析和測定門(mén)生2(37)1(3.5)3(36)3(40)2(4.0)1.0[5]沈加成酶解工業(yè)纖維廢渣生成乙醇技術(shù)的研究[D]濟南:山K12.3330010.東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗K212.33312.33333312.667[6 Helle SS, Duss SJB, Cooper DG. Effect of surfactants on cellulosK312.00033313.333hydrolysis[J]. Biotechnol Bioeng 1993: 42(5): 611-7.0.3331.0000.3332.666[7] Castanon M, Wilke CR Effects of the surfactant Tween-80matic hydrolysis of newspaper[J]. Biotechnol Bioeng, 1981由表1結果可以看出XxI11365-72①在9個(gè)處理的直觀(guān)分析中,第4個(gè)組合條件下燃[8] Kurakake M, Ooshima H, Kato J, Harano Y pretreatment o②從各個(gè)因子不同水平條件對燃料乙醇濃度的影 Kaar We,echn019,49:21-omyr料乙醇濃度最高,為14mgmL。從而可以確定第4個(gè)組合A2BC2D23為最佳條件組合Holtzapple M Benefits from Tween during enzymic中“+-+-+ hydrolysis of com stover[]. Biotechnol Bioeng 1998, 59: 419-27上接第22頁(yè))縮短為36h,酒精度達到了47%voleters[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 38 (5):參考文獻:7l1-718.5]Ozmihci, S, Kargi, F, Comparison of yeast strains for batch[1] Siso, M. L Gonza lez. The biotechnological utilization of cheeseethanol fermentation of cheese- whey powder( CWP)solution[J]whey: A review!]. Bioresource Technology, 1996, 57(1): 1-1lLetters in Applied Microbiology, 2007, 44(6): 602-6062]P. Gunasekaran,N.R. Kamini., High ethanol productivity from[6]周珺,肖冬光,郭學(xué)武,王艷混菌固定化發(fā)酵乳清生產(chǎn)燃料乙lactose by immobilized cells of Kluyveromyces fragilis and醇的研究[,釀酒科技,2008,1(163):42-44Zymomonas mobilis[J]. 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