PCR技術(shù)的研究及應用

第30卷第3期長(cháng)江工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報Vol 30 No. 32013年9月Journal of Changjiang Engineering Vocational CollSep.2013PCR技術(shù)的研究及應用張許文琦(華東理工大學(xué),上海200237)摘要:PCR技術(shù)是一種在體外對特定DNA序列進(jìn)行快速擴增的技術(shù)。因其較強的特異性和靈敏度以及檢測速度快準確性好等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛地應用于水產(chǎn)、微生物檢測等許多領(lǐng)域。本文從PCR技術(shù)的原理、分類(lèi)及應用方面進(jìn)行了綜述,并對其發(fā)展做出了展望。關(guān)鍵詞:PCR技術(shù);水產(chǎn);微生物中圖分類(lèi)號:Q50文獻標識碼:A文章編號:16730496(2013)03000404Research and application of PCr technologyZHANG XU Wen-qiEast China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)Abstract: PCR technology is to rapidly amplify certain dna sequence in vitro. Because of its multiple advantages such as strong specificity, sensitivity, quick detection with high accuracy, etc,PCR has been applied to plenty of fields including detecting aquatic products and microorganism.The review of PCR's principles, classification as well as application, and also preview of its futuredevelopment are made here.Key words: PCR; aquatic product; microorganism點(diǎn),實(shí)現在體外對特定DNA序列進(jìn)行快速擴增,可0前言在短時(shí)間內在試管中獲得數百萬(wàn)個(gè)特異DNA序列拷貝。PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)便、結果可靠,并被世界各分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子國廣泛應用于醫學(xué)、農業(yè)、考古學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的基因的功能、形態(tài)結構特征及其重要性和規律性的科學(xué),研究和分析,對分子生物學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了革命性的經(jīng)過(guò)幾十年的迅速發(fā)展已成為人類(lèi)從分子水平上真影響。發(fā)明人 Kary Banks Mulls也因此榮獲1994正揭開(kāi)生物世界的奧秘,由被動(dòng)地適應自然界轉向年度諾貝爾化學(xué)獎2。主動(dòng)地改造和重組自然界的基礎學(xué)科。分子生物學(xué)的研究?jì)热莅膫€(gè)方面DNA重組技術(shù),基因表1PCR技術(shù)的原理達調控研究,生物大分子的結構功能研究,基因組功能基因組與生物信息學(xué)研究。隨著(zhù)分子生物學(xué)PCR技術(shù)是根據待擴增的已知DNA片段序的迅速發(fā)展,相關(guān)的研究技術(shù)日臻完善,幾乎滲透到列、人工合成與該DNA2條鏈末端互補的2段寡核生命科學(xué)的全部領(lǐng)域。本文主要介紹PCR技術(shù)苷酸引物,在體外將待檢DNA序列(模板)在酶促PCR聚合酶鏈式反應 Polymerase Chain Re作用下進(jìn)行擴增。PCR的整個(gè)技術(shù)過(guò)程經(jīng)若干個(gè)action,PCR)是1985年由美國 PE-Cetus公司的科循環(huán)組成,一個(gè)循環(huán)包括連續的3個(gè)步驟學(xué)家 Kary Banks Mulls發(fā)明的一種可在體外快速第1步是高溫條件下的DNA模板變性,即模擴增特定基因或DNA序列的技術(shù)。這項新技術(shù)是板DNA在93~94℃的條件下變性解鏈根據生物體內DNA序列能進(jìn)行快速復制的某些特第2步是退火,即人工合成的2個(gè)寡核苷酸引物與模板DN中國煤化工退火;收稿日期:2013-0426作者簡(jiǎn)介:張許文琦(1992),女,武漢人,大學(xué),主要從事環(huán)境工程專(zhuān)第3步CNMH(物同時(shí)存在業(yè)研究的情況下,借助 TaqDNA聚合酶的作用,引物鏈將張許文琦PCR技術(shù)的研究及應用沿著(zhù)5’-3’方向延伸與模板互補的新鏈。經(jīng)過(guò)引物的GC含量則應與其類(lèi)似。一般情況下,設計這個(gè)循環(huán)后,合成了新鏈,可將其作為DNA模板繼引物時(shí),G+C堿基對含量以40%~60%為佳,解鏈續反應,由此循環(huán)進(jìn)行。溫度高于55℃。避免引物自身形成發(fā)夾結構等二循環(huán)進(jìn)程中擴增產(chǎn)物的量以指數級方式增加,級結構,尤其是兩個(gè)引物之間不應存在互補序列,尤般單一拷貝的基因循環(huán)25~30次,DNA可擴增其是在引物的3’末端,即使無(wú)法避免,其3’端的互100萬(wàn)~200萬(wàn)倍。PCR反應的步驟很簡(jiǎn)單但補堿基也不能多于2個(gè),以減少“引物二聚體”的形是具體的操作是復雜的,如退火溫度的確定、延伸時(shí)成,否則會(huì )影響靶DNA序列的擴增。在合成新鏈間的長(cháng)短以及循環(huán)數等。因此,不同的反應體系應時(shí),DNA聚合酶將單核苷酸添加到引物的3·末端,該確定適當的反應條件,以避免假陰性或假陽(yáng)性等因此引物3端的5~6個(gè)堿基與靶DNA片段的配情況的產(chǎn)生。對必須精確、嚴格。在PCR反應中,引物的適宜濃度為0.1~12PCR反應基本成分(mol/L)。引物濃度過(guò)高,容易形成非特異性擴增,引物濃度過(guò)低,不足以完成30個(gè)循環(huán),降低PCR的2.1模板DNA產(chǎn)量。通常模板DNA的量較多或高度復雜DNAPCR反應的模板可以是單鏈或雙鏈DNA,可如人類(lèi)基因組DNA作模板時(shí),引物濃度應低一些以是基因組DNA或CDNA,mRNA也可作為PCR模板DNA的量較少或低度復雜DNA如質(zhì)粒DNA的模板,只需用逆轉錄酶把mRNA逆轉錄為cDNA作模板時(shí)引物濃度應高一些。即可。由于PCR反應的特異性由寡聚核苷酸引物2.3 dNTPs決定,模板DNA不需要高度純化,但應避免任何蛋dnTPs(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)是PCR白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、能結合DNA的反應中靶DNA序列擴增的原料。在PCR反應中蛋白質(zhì)及多糖類(lèi)物質(zhì)的污染。選用純化的DNA做每種脫氧核苷三磷酸的濃度以50~200gmol/L為模板,可增加模板分子的濃度,除去可能抑制PCR宜,不能低于10~15pmol/L。濃度過(guò)高易引起非特反應的雜質(zhì)如SDS會(huì )嚴重抑制 TaqDNa聚合酶的活性,可顯著(zhù)提高PCR擴增的有效性。通常,模板異性PCR產(chǎn)物,當dNTP濃度高于50mmo/L時(shí)還DNA保存于10mmol/ L Tris-HCl(pH7.6)、0會(huì )抑制Taq酶的活性;濃度過(guò)低則影響擴增產(chǎn)量。mmol/ L EDTA(pH8.0)緩沖液中5。4種dNTP的摩爾濃度應相同,不平衡的濃度會(huì )導2.2引物致堿基錯配率上升,降低合成速度,導致反應過(guò)早終PCR引物是一段與待擴增的目標DNA序列側1。在10u的標準反應體系中,濃度5mol/L翼片段互補的寡核苷酸片段,長(cháng)度大多為10~30個(gè)和200mo/L的dNTP就足以分別合成6.5g和堿基。通常,一對引物包含5’端與正義鏈互補的寡Ag DNAL5]核苷酸片段和3端與反義鏈互補的寡核苷酸片段,24DNA聚合酶這兩個(gè)寡核苷酸片段在模板DNA上的結合位置之在100的PCR標準反應體系中, Taq dnA間的距離決定PCR擴增片段的長(cháng)度聚合酶的常用濃度為1~2.5U,人類(lèi)基因組DNA根據統計學(xué)計算,長(cháng)約17個(gè)堿基的寡核苷酸序作模板時(shí), Taq dna聚合酶的適宜濃度范圍為1~列在人類(lèi)基因組中可能出現的概率為1次。因此,4U。酶量過(guò)多會(huì )導致增加非特異性PCR產(chǎn)物,反只要引物不少于16個(gè)核苷酸,就能保證PCR擴增之會(huì )引起PCR產(chǎn)量不足。 Taq dna聚合酶作用時(shí)序列的特異性。引物過(guò)長(cháng)往往會(huì )降低其與模板的雜需要Mg2,每次擴增反應必須確定最佳Mg2濃交效率,從而減低PCR的反應效率度。 Pfu dNa聚合酶是一種具有高保真性能的高PCR反應成功的關(guān)鍵是設計最佳的引物。引溫DNA聚合酶來(lái)源于高溫嗜熱菌,分子量為物設計的先決條件是與引物結合的靶DNA序列必90kDa,適用于一般的PCR反應、基因克隆與表達須是已知的,與兩個(gè)引物結合的序列之間的靶DNA基因突變分析、全基因合成等。除 Taq dna聚合序列則未必清楚。設計引物時(shí)應盡可能選擇堿基隨酶、 Pfu dna聚合酶外,常見(jiàn)的DNA聚合酶還有:機分布的序列,盡量避免多嘌呤、多聚嘧啶或其他異 Tth dNA聚中國煤化工DNA聚合常序列。兩個(gè)引物中G+C堿基對的百分比(G+酶, Platium FCNMHGDNA聚合酶C%)應盡量相似,若待擴增序列中GC含量已知時(shí),(高保真)等s013年9月長(cháng)江工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報第30卷第3期2.5緩沖液線(xiàn)12。熒光信號在指數擴增階段,PCR產(chǎn)物熒光信PCR反應的標準緩沖液通常含有10mmol/號的對數值與起始模板量之間存在線(xiàn)性對應關(guān)系LTris-HCIe(pH8.3),50mmo/LKCl和1.5mmo/然后進(jìn)行定量分析1。MGcL2,基本適用于各種模板、寡核苷酸引物,但對3.1多重PCR技術(shù)某種模板與引物的特定組合就不一定最佳,用時(shí)需多重PCR( multiplex PCr)技術(shù)是PCR技術(shù)的再作適當調整。種,為同一管中加人多對特異性引物,與PCR管26Mg2+及其它成分內的多個(gè)模板反應,在一個(gè)PCR管中同時(shí)檢測多個(gè)PCR反應體系中Mg2的濃度十分重要,適宜目標DNA分子。多重PCR技術(shù)可以擴增一個(gè)物的Mg2濃度為高于dNTP總濃度0.5~2.5mmol/種的一個(gè)片段,也可以同時(shí)擴增多個(gè)物種的不同片L。當dNTP濃度為0.2 mmol/L時(shí),建議Mg2的段濃度為1mmol/L。Mg2+濃度過(guò)高,容易生成非特在同一反應體系中,多重PCR技術(shù)進(jìn)行多個(gè)位異性擴增產(chǎn)物;反之,濃度過(guò)低會(huì )使PCR產(chǎn)量降低。點(diǎn)的特異性擴增時(shí),引物間的配對、引物間的競爭性Mg2的有效濃度受到高濃度的螯合劑如EDTA、高擴增等會(huì )對擴增效果產(chǎn)生重要影響。一方面,如果濃度的帶負電荷離子基團如磷酸根的影響,它們可能選擇適宜的反應體系和反應條件,可極大地提高與Mg2+結合從而降低Mg2的有效濃度。因此,每多重PCR的擴增效果15。主要包括退火溫度、退當首次使用靶序列、引物、dNTP(含磷酸根)的新組火及延伸時(shí)間、PCR緩沖液成分、dNTP的用量、引合時(shí),都要將Mg2濃度調至最佳。通常的方法是物及模板的量等。另一方面,DNA的抽提質(zhì)量也影設置一組反應,每一反應的KCl(50mmo/L)和Tris響多重PCR擴增效率。如DNA抽提不干凈或降HCl(10mmol/L)濃度相同,而MgCl2濃度不同解都將影響PCR擴增效果6)。(0.05~5mmol/L),每次增加(0.5mmol/L),反應3.3單分子PCR技術(shù)(SM-PCR)結束后,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電單分子PCR技術(shù)是在傳統PCR技術(shù)的基礎上泳來(lái)比較各反應擴增產(chǎn)物的量,從中選出最佳的發(fā)展的,基本循環(huán)過(guò)程相同,但在反應條件、模板數Mg2濃度量、DNA聚合酶選擇、引物設計方面具有不同點(diǎn)該技術(shù)是以少量或單個(gè)DNA分子為模板進(jìn)行的3PCR技術(shù)的分類(lèi)PCR。單分子PCR技術(shù)反應中,DNA模板濃度極低3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)這就要求模板有較高的質(zhì)量,這是試驗成敗的決定1996年,學(xué)者經(jīng)過(guò)研究,在傳統PCR技術(shù)的基性因素。在設計引物時(shí),應該嚴格控制GC的含量礎上,首創(chuàng )了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),新技術(shù)已經(jīng)和T值,同時(shí)盡量避免引物間存在可配對序列。在應用至醫學(xué)領(lǐng)域、分子生物學(xué)和其他基礎研究領(lǐng)域。反應混合物模板數極低的情況下,若引物之間存在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)基于傳統技術(shù)的優(yōu)勢,還具少量配對序列擴增時(shí)極易形成二聚體,使反應無(wú)法有實(shí)時(shí)性、準確性、無(wú)污染,實(shí)現了自動(dòng)化操作和多重進(jìn)行,得不到所需要的產(chǎn)物。由于單分子PCR技術(shù)反應,是PCR技術(shù)研究史上從定性到定量的飛躍。反應的變性溫度(96~98℃)大多比常規PCR技術(shù)熒光定量PCR技術(shù)最大的特點(diǎn)是能將熒光基(94℃)略高,因而對DNA聚合酶熱穩定性的要求團加入到PCR反應體系中,借助于熒光信號,累積也更加嚴格,需要有較好的熱穩定性,以防止溫度過(guò)實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知高而使其失活。其變性時(shí)間(5~15s)、退火時(shí)間及模板進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)監測這一特點(diǎn)是常規延伸時(shí)間也短于常規PCR技術(shù)。PCR技術(shù)所不具有的,因為其對擴增反應不能進(jìn)行隨時(shí)的檢測。常規PCR技術(shù)的擴增終產(chǎn)物需要在凝膠電汰等條件下才能進(jìn)行無(wú)法對起始模板進(jìn)行4PCR技術(shù)的應用準確的定量,而熒光定量PCR技術(shù)的反應進(jìn)程可以4.1PCR技術(shù)在水產(chǎn)上的應用根據熒光信號的變化做出準確的判斷0-1。一個(gè)基因表達是檢測某個(gè)基因在不同發(fā)育期或不同PCR循環(huán)反應結束之后,定量PCR儀可以收集1組織中的表達中國煤化工處理過(guò)程中個(gè)熒光強度信號熒光信號強度的變化可以反映產(chǎn)的影響而出現CNMH學(xué)者應用real物量的變化情況這樣就可以得到1條熒光擴增曲 time PCr技不餅旯咴水化合初量對翹嘴紅鮑張許文琦PCR技術(shù)的研究及應用糖代謝酶G6Pase、GK以及 PEPCK表達量的影表達差異[D曲阜:曲阜師范大學(xué),2011響13-),研究結果可為翹嘴紅鮐飼料配方中的最合[4]常世敏PCR在食品微生物檢測中的應用邯鄲農適糖含量提供理論依據。孫淑娜等2研究葉酸拮業(yè)高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報,200,.1(4):2325.抗劑對斑馬魚(yú)心臟發(fā)育相關(guān)基因BMP2b及HAS2[5]鄭景生呂蓓.FCR技術(shù)及實(shí)用方法[J].分子植物育種,2003,1(3):382.表達的影響,表明葉酸拮抗劑對早期胚胎的心臟發(fā)[6] Krawetz S. A,PonR.T., and dixon g,H,lh育影響較大,可導致斑馬魚(yú)心臟發(fā)育延遲及心臟形 creased efficiency of the Taqpolymerase catalyzed polymerase態(tài)異常,并下調斑馬魚(yú)心臟發(fā)育相關(guān)基因BMP2 b chain reaction, Nucleic Acids,Res,1989,17,819及HAS2的表達,這可能是葉酸生物學(xué)活性受抑后[7]金冬雁等(譯),分子克隆實(shí)驗指南(第二版北京:科導致心臟發(fā)育異常的機制之一。 Sawyer et al2以學(xué)出版社,19934+342.5657,.7262斑馬魚(yú)的未受精卵、胚胎、仔魚(yú)和成魚(yú)為研究材料,[8] KUBISTA M, ANDRADE J M, BENGTSSON M,etal. The real-time polymerase chain reaction [JJ. Molecular采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),檢測了P450 aroma Aspects of medicine,.00.723):9515和P450 aromA在不同組織的表達量,表明在各組織[9 AGINdOTAN BO, SHIEL P J, BERGER P H. Simul-中均有2種基因的表達,但表達量顯著(zhù)不同,呈現組 taneous detection of potato viruses,PLRv,PvA, PVX and織特異性。PVY from dormant potato tubers by Taq Man real-timeRT4.2PCR技術(shù)在微生物檢測上的應用PCRD]. 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Differentiation of Potato virus y strains u明實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有快速檢測、準確、客 ing improved sets ofdiagnostic-PCRPCR- primers[J].J VirolMethods,2007,140(1-2):6674.觀(guān)等優(yōu)勢,優(yōu)于傳統的檢測方法243。 Metzger[t3]袁繼紅實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的實(shí)驗研究[J現代Bodden et a1對 PCR-ELISA的方法進(jìn)行了評價(jià),農業(yè)科技,2010,(1322結果顯示樣品中沙門(mén)氏菌的檢出率可以達到98%[14]朱善元生物檢測技術(shù)PCR及其在獸醫微生物檢測中的應用[J.黑龍江畜牧獸醫,199,(11):21-22.[15]黃銀花等影響多重PCR擴增效果的因素[J.遺傳5結語(yǔ)2003,25(1):6568PCR技術(shù)是現代分子生物學(xué)和生物工程技術(shù)16陳諾等多重PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應的靈魂,掌握PCR技術(shù)是進(jìn)人分子生物學(xué)研究的鑰[17]劉連生常規PCR技術(shù)與單分子PCR技術(shù)[醫學(xué)匙。隨著(zhù)現代分子生物學(xué)的迅速發(fā)展、科學(xué)技術(shù)的信息,2010,23(11:4379438不斷進(jìn)步,PCR實(shí)驗方法將變得更加簡(jiǎn)單、快速、有18]唐永凱等翹嘴紅鮑肝臟G6Pase催化亞基的克隆以效。PCR技術(shù)正向著(zhù)簡(jiǎn)便、快捷、實(shí)用、低成本、高及攝食和飼料中碳水化合物對其表達的影響[水產(chǎn)學(xué)報,質(zhì)量、智能化的方向發(fā)展同時(shí)PCR技術(shù)的應用也200.3101453將不斷深入到人類(lèi)涉及的各個(gè)方面,甚至進(jìn)入尋常19]劉波等高碳水化合物日糧對翹嘴紅舶生長(cháng)、GK及 GK mRNA表達的影響[J.水生生物學(xué)報,2008,32(1):家庭中47-53在如今的環(huán)境保護工作中,生物處理是最常被20]俞菊華,等碳水化合物脂肪對翹嘴紅館 PEPCK基運用的方法,利用各種方法,我們可以根據需求去培因表達的影響門(mén)].水產(chǎn)學(xué)報,2007,31(3):369373育、改造微生物,讓它們?yōu)槲覀兯?。[21]孫淑娜,等.葉酸拮抗劑甲氨喋呤導致斑馬魚(yú)心臟發(fā)育異常及BMP2bHAS2表達下調[J].中國當代兒科雜志參考文獻:2007,9(2):159-163[1]覃擁靈.分子生物學(xué)技術(shù)及其在環(huán)境污染治理中的應[ 22] SAWYER S J, GERSTNER K A, CALLARD G Real-用研究進(jìn)展[J.河池學(xué)院學(xué)報,2005,25(2):24time pCR analysis of cytochrome P450 aromatase expression in[2]張晶,張惠文張成剛實(shí)時(shí)熒光定量PCR及其在微zebra fish: gene specific tissue distribution, sex differences, devel生物生態(tài)學(xué)中的應用[J.生態(tài)學(xué)報,20025(6):1445- omental programming; and estrogen regulation[J ]. General and中國煤化工71450.[3]謝海燕黑線(xiàn)倉鼠LHR部分序列克隆及組織器官的CNMHG下轉第12頁(yè))2013年9月長(cháng)江工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報第30卷第3期現的較大拉應力,最大拉應力為1.88MPa。工時(shí)未按設計要求預留收縮縫,大壩為全年施工,溫從以上計算結果來(lái)看,大壩壩體主壓應力均小控措施也未達到設計要求,再加上1991年和1997于砌體的容許壓應力6.0MPa,故滿(mǎn)足規范要求。年都遭“低溫+高水位”的不利荷載組合。裂縫削弱工況1、工況2、工況5得到的大壩壩體主拉應力略拱的作用且增大了壩體揚壓力,導致壩體應力重大于計算拉應力參考值。究其原因,主要是《砌石壩分布。目前兩支測縫計測值受氣溫影響較小,但隨設計規范》(SL25-2006)要求按照《混凝土拱壩設計著(zhù)時(shí)間的推移略有增大跡象,應加強觀(guān)測規范》(SL282-2003)的要求,有限元法計算成果應(3)結構計算分析表明,大壩砌體主應力在各種補充計算“有限元等效應力”,而本計算成果中存在工況下主壓應力均滿(mǎn)足規范要求,大壩壩體主拉應應力集中現象。通過(guò)對應力集中部位的節點(diǎn)應力補力基本滿(mǎn)足規范要求?？紤]到拱壩的受力特性,其充計算有限元等效應力,可知壩體主拉應力在基本結構安全基本滿(mǎn)足規范要求。荷載組合(工況1~工況4)時(shí),小于1.20MPa;特殊荷載組合(工況5)時(shí),小于1.50MPa。故總體計算參考文獻:得到的強度結果基本滿(mǎn)足規范要求。[1]馬福恒,劉成棟.安徽省黃山市毛坦水電站大壩安全綜合評價(jià)報告[R]南京:南京水利科學(xué)研究院,2004[2]程云峰毛坦水電站砌石拱壩裂縫的環(huán)氧灌漿[].小4大壩結構安全性態(tài)評價(jià)水電,2002,(5):15~16[3]砌石壩設計規范SIL25-2006(1)變形觀(guān)測資料分析表明,大壩壩體位移變化[4]混凝土拱壩設計規范SL28200符合拱壩的一般變形規律,大壩變形整體協(xié)調性好。[5]周磊等.毛坦砌石拱壩應力和變形分析[門(mén)水電能(2)經(jīng)分析,壩體裂縫產(chǎn)生的主要原因是壩體施源科學(xué),2009,(3):67~70.·@····················aa·小·····a··,·,·······合·(上接第7頁(yè))of virologicalMethods, 2003, 111(2):95-100[23] BF3 A K, MAHBUBANI M H, MILLER R, et al. 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