聚乙二醇修飾β-干擾素的研究

微生物學(xué)兔疫學(xué)進(jìn)展2004年第32卷第3期聚乙二醇修飾β千擾素的研究徐靜,倪道明,張振龍(北京生物制品研究所,北京100024)摘要:采用平均分子量為5kD的已活化的單甲氧基聚乙二醇(mPEC)對重組人β干擾素( rhIFN-B)進(jìn)行化學(xué)修飾。優(yōu)化修飾條件選擇對血hIFNβ反應性高的修飾劑制備三種不同修飾程度的修飾物,并對修飾物進(jìn)行初步檢定。三種修飾物的修飾率分別為10.12%、22.99%、42.47%;比活性分別保留為原來(lái)的93.53%、48.69%、13.18%;PEG修飾后的 rhIFNβ在pH7時(shí)的溶解度增加關(guān)鍵詞:重組人β-干擾素;聚乙二醇;化學(xué)修飾中圖分類(lèi)號:R392.11文獻標識碼:A文章編號:10055673(2004)03000404Preliminary study on chemical modification of interferon-B by polyethylene glycol XU Jing, NI Dao-ming, ZHANGZhen-long( National Vaccine and Serum Institute, Beijing 100024, ChinaAbstract: rhIFN-B was modified by activated methoxypolyethylene glycol( mPEG). With the optimization of modifying con-ditions, CC-mPEG was chosed to modify rhIFN-B and three peglated rhlFN-B were prepared, the extents of modification are10. 12%,22.99%, and 42. 47% respectively. Specific activity of three peglated rhIFN-B is 93. 53%, 48. 69%, 13.18%of original hIFN-B respectively. Polypeglation had effect on the configuration of rhIFN-B. The peglation increased the solubility of rhIFN-B at neutral pH.Key words: rhIFN-B: Polyethylene glycol; Chemical modificationhFNβ是一種多功能細胞因子,它可以在細胞大腸桿菌表達的 rhIFN-Bserl7為北京生物制品表面與特殊的受體結合而發(fā)揮抗病毒、抗細胞增殖和研究所中試一室提供(純度為95%以上),氰尿酰氯免疫調節作用。1993年,hFN-B獲美國FDA批準用活化的單甲氧基聚乙二醇(mPEC)、琥珀酸琥珀酰于多發(fā)性硬化癥(MS)的治療。另外hFNB也可亞胺酯活化的mPEG、對硝基苯碳酸酯活化的以用于上皮癌、腎癌、基底細胞癌、乙型肝炎、丙型肝mPEG2,4,6-三硝基苯磺酸均購自SGMA公司,水炎等疾病的治療。與其它基因工程類(lèi)藥物一樣,由于合茚三酮購自北京化學(xué)試劑公司,水皰性口腔炎病缺乏天然蛋白質(zhì)所具有的糖基hFNB的半衰期短毒(ⅤsV)、人羊膜細胞均為北京生物制品研究所中并具有一定的免疫原性疏水性較強等特點(diǎn)因此存試一室保存, rhIFN-B ser17國際標準品購自英國在著(zhù)進(jìn)一步改善thNB的臨床治療效果的需求。NBSC1977年 Abuchowski等證明:作為治療藥物聚乙二醇2透析 rhIFN-B(PEG, polyethylene glycol)修飾的蛋白質(zhì)比未修飾的透析液為含有0.1%SDs的0.1mo/L的四硼蛋白質(zhì)更有效。目前國內外已經(jīng)嘗試用PG對酸鈉溶液pH值為92。透析后取樣,Lowy法測多種蛋白質(zhì)類(lèi)藥物進(jìn)行修飾,并取得了一定的進(jìn)展,定 rhIFN-B蛋白濃度如腺苷脫氨酶、天冬酰胺酶、粒細胞集落刺激因子、以3修飾條件的優(yōu)化及修飾劑的選擇及兩種亞型a-千擾素的PEG修飾物已獲美國FDA3.1反應時(shí)間對修飾反應的影響批準上市。作者用PEG對研制的 rhIFN-B serl7進(jìn)行取透析后的 rhIFN-B(1.18lmg/ml)3ml,按了化學(xué)修飾優(yōu)化修飾條件,并對修飾物的一般生物50:1的比例加入氰尿酰氯活化的mPEG(CC學(xué)特性進(jìn)行檢定。mPEG),25℃振蕩反應。分別于0.5、1234h取出材料與方法0.5ml,用三硝基苯磺酸(TNBS)法{測修飾率。琥珀酸琥珀酰亞胺酯活化的mPEC(Ss-mPEC)、對硝材料基苯碳酸酯活化的mPEG( NPC-mPEG)以相同的方收稿日期:2003-1215;修回日期:20040202作者簡(jiǎn)介:徐靜(1974),女,碩士,主要從事基因工程產(chǎn)品的研究開(kāi)發(fā)工作。微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展2004年第32卷第3期法進(jìn)行測定,用三硝基苯磺酸法(TNBS)測定SS-將pH值調到8.0,以 Sephadex G25為層析介質(zhì),上mPEG的修飾率,茚三酮法(測定 NPC-mPEG的修樣后,用pH8.0的20mmo/L的磷酸鹽緩沖液洗飾率52PEG2、PEC3的純化3.2反應溫度對修飾反應的影響將修飾后樣品pH值調到5.5,以 Sephacryl S-取透析后的 rhIFN-B(1.18lmg/ml)3ml,按100為層析介質(zhì),上樣后,用含0.1% SDS pH5.5的20:1的比例加入 CC-mPEG,混勻,分裝于3支試管50mmo/L的醋酸緩沖液洗脫。將 Sephacryl S-00中,每管lml,于4℃反應2h4℃反應Ih再25℃反凝膠過(guò)濾后樣品濃縮,調pH值到8.0,以 Sephadex應1h、25℃反應2h,測定修飾率。 SS-mPEG和NPCG25為層析介質(zhì),上樣后,用pH8.0的20mmo/LmPEC以相同的方法進(jìn)行測定。的磷酸鹽緩沖液洗脫。33溶液pH值對修飾反應的影響6修飾物的一般生物學(xué)特性檢定取透析后 rhIFN-P(1.18lmg/ml)5ml,分別取用TNBs法測定三種修飾物的修飾率。做非還lml置于5支試管中,調節pH值分別為7.074、原 SDS-PAGE,用 TotalLab1 D Gel analysis vI.0軟件8.084、9.2。每支試管分別加入 CC-mPEG6mg,對PEG1膠帶進(jìn)行掃描,分析純度。在 WISH-VSV4℃振蕩反應2h,用5mo/ L NaOH將各樣品pH調系統上按細胞病變抑制法測定hFNB及其三種修至92,測修飾率。 SS-mPEG和 NPC-mPEG以相同飾物的生物學(xué)效價(jià)用Lowy法測定蛋白含量(3,計的方法進(jìn)行測定。算每種樣品的比活性,比較hFNB及其三種修飾34 rhIFN-B濃度對修飾反應的影響物的比活性取0.6ml透析后的hlFN-β(8.36mg/ml),按7 rhIFN-β及其三種修飾物溶解度的比較10:1的比例加入 CC-mPEG,混勻,立刻倍比稀釋4分別取0.2mg/ml的thFN-β及其三種修飾物次,使溶液中 rhIFN-B濃度分別為8.36mg/ml4.182.5ml,通過(guò) Sephadex G25凝膠過(guò)濾將緩沖液置換mg/ml2.09mg/ml、1.045mg/ml0.523mg/ml,4℃為不含SDs、pH9.0、20mmol/L的磷酸氫二鈉溶液。振蕩反應2h,測定修飾率。 SS-mPEG和 NPC-mPEG取樣進(jìn)行220-1000m紫外可見(jiàn)光譜掃描將pH以相同的方法進(jìn)行測定。調至70,室溫放置過(guò)夜,再進(jìn)行同樣的掃描。同時(shí)3.5反應物摩爾比對修飾反應的影響肉眼觀(guān)察各溶液在不同pH值時(shí)的渾濁度。取透析后的hFN-B(1.18lmg/m)4ml,分別取結果lml置于4支試管中,分別按5:1、10:1、20:150:1的比例加人 CC-mPEG,4℃振蕩反應2h,測定1修飾條件對修飾反應的影響修飾率。SS-mPEC和 NPC-mPEG以相同的方法進(jìn)1.1反應時(shí)間對修飾反應的影響行測定。三組反應在0.5h時(shí)即有一定的修飾率,隨著(zhù)時(shí)4修飾物的制備間的增加,修飾率也隨之增加。雖然2h以后修飾率取透析后rhFN-B(5.166mg/ml)l5ml,均分于3仍有增加,但增加幅度不明顯(圖1)。 SDS-PAGE支試管中分別按5:1、10:1、2.5:1的比例加入顯示,隨著(zhù)反應時(shí)間的增加修飾物的不均一性增加CC-mPEG,25℃振蕩反應2h,加入30%的冰醋酸終(圖略)。綜合考慮,為此選擇2h作為修飾反應的止反應。制備修飾程度分別為低、中、高的三種修飾時(shí)間。 CC-mPEG的修飾率明顯高于其他兩種PEG物,分別命名為PEGI、PEC2、PEG3。的修飾率,在此條件下CC-mPEG更適合用來(lái)修飾5修飾物的分離純化ThIFN-B5.1PEGI的純化1.2反應溫度對修飾反應的影響以 Sephacryl S200為層析介質(zhì),將修飾后樣品實(shí)驗結果表明,在很溫和的實(shí)驗條件下(4℃或上樣用50mmo/L的醋酸緩沖液洗脫。 SDS-PAGE25℃)修飾反應即可發(fā)生,隨著(zhù)溫度的升高,修飾率分析各組分選擇性地收集以結合單個(gè)PEG分子的會(huì )有所上升,但增加幅度不明顯(圖1)。為了盡可rhIFN-B為主的組分。將樣品濃縮后,再以 Sphaer能地減少對hFNB生物學(xué)活性的影響故選擇4℃yls-00為層析介質(zhì)進(jìn)行凝膠過(guò)濾 SDS-PAGE分析作為反應溫度。同等條件下,CC-mPEG的修飾率明各組分,收集以結合單一分子PEG的 rhIFN-B為主顯高于其他兩種PEG的修飾率,說(shuō)明在此條件下的組分。將 Sephacryl S100凝膠過(guò)濾后樣品濃縮, CC-mPEG更適合用來(lái)修飾hFNB。微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展204年第32卷第3期1.3溶液pH值對修飾反應的影響隨著(zhù) rhIFN-B蛋白濃度的增加,各組修飾反應pH值越高,反應的修飾率越大(圖1)。但pH值的修飾率有所增加(圖1)?？赡苡捎跐舛鹊脑黾蛹舆^(guò)高,會(huì )影響蛋白質(zhì)的穩定性,考慮到hFNB在大了thIN-β分子與PEG分子之間接觸、碰撞的機H時(shí)能夠保持穩定,對活性沒(méi)有明顯影響因此選會(huì ),但濃度加大的同時(shí)也增加了thFN-B形成多聚擇pH9.2作為反應體系的pH值。同等條件下,CC體的機會(huì )。為了兼顧兩方面的因素,選擇5mg/mlmPEG的修飾率明顯髙于其他兩種PEG的修飾率說(shuō)的蛋白濃度作為修飾反應中 rhIFN-B的最適濃度。明在此條件下 CC-mPEG更適合用來(lái)修飾hFN-B。同等條件下,CC-mPEG的修飾率明顯高于其他兩種1.4hFN-β濃度對修飾反應的影響PEG的修飾率。40.00%3400030.00%0.51230.00%4t24℃ h25TIh 2℃2hTite (h)77.488.49.225.00%20.00%15.00%10.0020.00%0.00%0.5231.0452.094.188.36102050圖1各種修飾條件對修飾反應的影響1.5反應物摩爾比對修飾反應的影響隨著(zhù)PEG與hIFN-B摩爾比的增加,修飾率明顯增加(圖1)。因此,在修飾物的制備過(guò)程中,可以根據對修飾程度的不同需求選擇合適的PEG與hFNB摩爾比。同等條件下, CC-mPEG的修飾率仍明顯高于其他兩種PEG的修飾率2修飾物的純化PEC經(jīng)過(guò) Sephacryl S200、 Sephacryl S-100、aiKdSephadex G25三步分離純化, SDS-PAGE電泳顯示主要為結合1分子的PEC,電泳掃描顯示純度達9501%;PEC2純化后主要為結合2分子的PEG;純化后的PEC3平均每分子thNB結合4分子的圖2rhNβ及其三種修飾物的 SDS-PAGEPEG,見(jiàn)圖2Fig. 2 Analysis of rAIFN-B and its three3修飾物的一般生物學(xué)特性檢定conjugates by測定純化后三種修飾物的修飾率,PECl為10.12%、PEG2為22.99%、PEG3為4247%。rhIFN-B; Lane c: PEGI; Lane d: PEG2; Lane e: PEG3傲生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展2004年第32卷第3rhIFN-B及其三種修飾物的比活性比較結果見(jiàn)表1。PEG的修飾對 rhIFN-p的活性有影響影響程度與三種修飾物的比活性均有不同程度的下降,分別為修飾程度相關(guān)。修飾前 rhIFN-B的95.36%、48.49%、13.30%,說(shuō)明表1 rhIFNβ及其三種修飾物比活Table 1 Specific activity of rhIFN-B and three modified rhIFN-BConcentrationActivitySpecific activiySpecific activity(IU)(IU/mg)preserving( %rhIFN-B0.2205.13×10°2.33×10PEGI0.2122.18×10393.56PEG2PEG30.2260.70×10°0.31x1013.304溶解度比較子PEG時(shí),活性降低不明顯,為修飾前的93.53%。肉眼觀(guān)察,hFNB溶液于pH9.0時(shí)澄清透明,說(shuō)明結合一分子的PEG并不會(huì )對hFNB與受體當將pH調到7.0后,溶液渾濁、有顆粒狀物析出。的結合有太大的影響。紫外可見(jiàn)光譜掃描結果顯三種修飾物在pH9.0和pH7.0時(shí)溶液均為澄清透示,單一分子PEG的修飾并未影響芳香族氨基酸在明。掃描結果顯示(圖略),hFNB溶液在pH9.0 rhIFN-B結構中的暴露程度,而多分子的PEG修飾時(shí)的掃描結果與規程一致;溶液在pH7.0時(shí)的掃描對芳香族氨基酸的暴露程度有影響,因而改變了結果顯示,hFN甲在278m的特征吸收峰消失,大hFNB的光譜學(xué)特性。溶解度研究結果表明,三波長(cháng)時(shí)的吸收明顯增強。三種修飾物在pH9.0和種修飾物在中性pH值時(shí)的溶解度均要高于thFNpH7.0時(shí)的掃描圖譜無(wú)明顯差異。說(shuō)明PEG對β與文獻報道一致。修飾后hFNB的抗原性體hIFN-β的修飾增加了其在中性pH時(shí)的溶解度。內外穩定性的變化、藥物代謝動(dòng)力學(xué)等性質(zhì)正在研討論究中。參考文獻:選擇應用較廣的三種已活化的PEG:CC-(1) Jacobs L, Gookin DE, Rudick RA,eal. Advances in specificmPEG、 SS-mPEG、NPC-mPEG進(jìn)行研究,最后選擇對therapy for multiple sclerosis[ J]. Curr Opin Neuro 1994, 7(3)hFNB反應性最高的 CC-mPEG對hFNB進(jìn)行修(2) Abuchowski A, McCoy JR, Palczuk NC, et al. Effect of covalent飾。PEG修飾對 rhIFNβ有正負兩方面的影響(延attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulat長(cháng)半衰期降低生物活性),為了探討究竟哪一種修ing life of bovine liver catalase[ J]. J Biological Chem 1977, 252飾程度更適合對研制長(cháng)效 rhIFN-B的要求,制備三(11):35823586種修飾程度不同的修飾物。選擇凝膠過(guò)濾方法對(3)中國生物制品標準化委員會(huì )編中國生物制品規程200年飯版化PEG1的目的。由于對PEC2、PEC3只是探索(4(S.化學(xué)工業(yè)出版社,672.PEGl進(jìn)行純化,純度分析結果表明,達到了高度純4) Habeeb AFSA, Determination of free amino groups in proteins bytrinitrobenzenesulfonic acid (J]. Analytical Biochemistry 1966研究,因而沒(méi)有對它們進(jìn)行高度純化。PEG的修飾對 rhIFN-B的活性有影響,三種修飾物的比活性均(5)田濕姚文兵吳梧櫚等聚乙二醇對干擾素a2b的初步化有不同程度的下降,分別為修飾前 rhIFN-B的奎飾研究〔〕.中國藥科大學(xué)學(xué)報2000,31(1):747793.53%、48.69%、13.18%。當血FNB結合一分