水稻秸稈同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的研究

釀酒科技2010 年第2期(總第188期)-LIQUOR-MAKING SCIENCE & TECHNOLOGY 2010 No.2[Tol.188)水稻秸稈同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的研究沈進(jìn)軍1.2,3 ,趙劍鋒1.2.3,張順萍3.4,曹曉華},楊志堅'2,許明(1.農業(yè)部海峽兩岸農業(yè)技術(shù)合作中心,福建福州350002;2.福 建農林大學(xué)農產(chǎn)晶品質(zhì)研兗所,福建福州350002;3.福建農林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建福州350002;4.福建農林大學(xué) 菌物研究中心,福建福州350002)摘要:研究了培養基起始pH、發(fā)酵時(shí)間.發(fā)酵溫度、酵母接種量和吐溫80對水稻秸稈同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響。結果表明,酵母接種量能有效地提高發(fā)酵液中乙醇的產(chǎn)率。水稻秸稈同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的適宜發(fā)酵工藝條件為:起始pH值為4.0~4.5,培養溫度為32C,接種量為12%,發(fā)酵時(shí)間12~24h。在此條件下,生成乙醇的濃度為1.4 mg/mL,水稻秸稈原料的乙醇轉化率達7.02 %。關(guān)鍵詞:燃料乙醇; 水稻秸稈; 同步糖化發(fā)酵; 哈茨木霉中圖分類(lèi)號:TS262.2;TS261.4;TS261.2文獻標識碼:A文章編號: 1001-9286<2010)02- 0023-04Research on the Production of Fuel Ethanol by SimultaneousSaccharification and Fermentation of Rice StrawSHEN Jin-jun", ZHAO Jjan- feng'2, ZHANG Shun-ping3^ ,CAO Xiao-hua;,YANG Zhi-jian'2 and XU Ming(1. CrosStrait Agricultural Technology Cooperation Center ,Ministy of Agriculture, Fuzhou, Fujian 350002 ;2. AgriculuralProduct Quality Institute , Fujian Agriculture and Forestry University , Fuzhou, Fujian 350002 ;3. College ofLife Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University ,Fuzhou, Fujan 350002;4. Mycological Research Center,Fujan Agriculture and Forestry University , Fuzhou,Fujian 350002, China)Abstract: The efeets of dfferent conditions incuding initial pH value of culture medium, fermentation time, fermentation temperature, and yeastinoculation quantity and Tween-80 on simultaneous saccharification and fermentation of rice straw to produce fuel ethanol were investigated. Theresults showed that yeast inoculation quantity could effectively increase ethanol yield in fermenting liquid. Under the optimum fermentation con-ditions (nitial pH as 4.0~4.5, fermentation temperature at 32 C, and yeast inoculation quantity was 12 %, and fernentation time was 12~ 24 b),the produced ethanol content was 1.4 mg/mL and the conversion rate from rice straw to ethanol was 7.02 %.Key words : fuel ethanol; rice straw; simulaneous saccharification and fermentation; Harianum Trichoderma以非糧食與經(jīng)濟作物為纖維素原料的生物燃料乙醇皮,葡萄糖20g,瓊脂粉20g,用水定容至1L。生產(chǎn)是決定未來(lái)大規模替代石油的關(guān)鍵。我國是農業(yè)大基礎固體產(chǎn)酶培養基:稻草粉4g,麩皮1g,無(wú)機鹽國,每年可產(chǎn)生秸稈7億多t,相當于315億t標準煤,但培養液15mL(KH2PO,4g/L,NH)zSO416g/L,Mg-目前大量秸稈就地焚燒既污染環(huán)境又浪費能源。因此,在SO41 g/ L)"。我國開(kāi)發(fā)利用秸稈生產(chǎn)燃料乙醇更具有現實(shí)意義。而水- -級種子培養基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨5g/L,酵母稻秸稈是我國三大農作物秸稈之一，約占全國秸稈總量膏3g/L,自然pH。的25.10%。因此,研究利用水稻秸稈產(chǎn)乙醇是解決人類(lèi)二級種子培養基:葡萄糖30g/L,蛋白胨5 gL,酵母糧食、能源、環(huán)境三大危機的重中之重,有利于解決秸稈就地焚燒造成的污染和浪費,并可增加農民收入,這符合乙醇發(fā)酵培養基;稻草粉2 g,纖維素酶液按20 IU/g我國“三農問(wèn)題"的需求,也符合我國農業(yè)可持續發(fā)展與稻草粉加入,酵母菌以10%接種量加入。生態(tài)農業(yè)發(fā)展的需求。.2 菌種哈茨木霉(Harianum Trichoderma);葡萄牙假絲酵母1材料與方法(Candida lusitaniae)。1.1培養基馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基:馬鈴薯200 g、去.中國煤化工稈2g,纖維素酶液按基金項目:省科技創(chuàng )新平臺建設計劃項目“福建省特種稻創(chuàng )新平臺建設"(2007S1YHC N M H G稻育種與綜合利用技術(shù)研究"(2008N20001-4)。收稿日期:2009-12-17作者簡(jiǎn)介:沈進(jìn)軍(1983-),男,碩士研究生.研究方向:應用微生物。通訊作者:許明(1978-),男,博士,主要從事特種稻育種與利用研究。23釀酒科技2010 年第2期(總第188期).LIQUOR-MAKING SCIENCE & TECHNOLOGY 2010 No.2(ol.188)20 IU/g稻草粉加入，酵母菌以10 %接種量加入,瓶口塞◆乙醇+還原糖橡皮塞(插有針頭,以排出生成的CO2)以控制厭氧條件,在不同溫度、不同時(shí)間、不同接種量、不同起始pH值等.成0條件下進(jìn)行燃料乙醇發(fā)酵的單因子影響試驗和正交試0.8驗,測定發(fā)酵醪液中燃料乙醇的濃度、糖分含量。0.60.441.4酶活力測定方法.0.2濾紙酶(FPA)活力:通常以濾紙酶活力(FPA)代表纖12維素酶的總活力，按照國際理論和應用化學(xué)協(xié)會(huì )(IU-時(shí)間(h)PAC)推薦的國際標準方法測定叫,以國際單位IU表示。圖1時(shí)間對同步 糖化發(fā)酵的影響試管中放人1x6 cm whatmanNo.l濾紙(約50 mg)- - 條，接種的酵母數量有限，總代謝速度低于較高的酶解產(chǎn)糖加入0.5mL適當稀釋的纖維素酶液和1.5mL檸檬酸緩速度所致。另外,采用的酵母對于底物中復雜的成分可能沖液(pH4.8),于50 C水浴60 min?？瞻自囼炛谐敢菏滦枰欢ǖ倪m應過(guò)程才可以發(fā)揮作用。在發(fā)酵中后期,發(fā)先滅活外,其余條件不變。反應結束后用DNS法測定所酵液中幾乎沒(méi)有明顯的葡萄糖殘余。在起初的24h內，得的還原糖含量。個(gè)濾紙酶活力國際單位(FPIU)等于酶促反應中每乙醇濃度一直上升,當培養到24 h,乙醇濃度達到最大,分鐘生成1.0μmol葡萄糖(以還原糖表示)所需的酶量。乙醇濃度達1.400 mg/ mL,36h后，乙醇濃度開(kāi)始下降，因此,發(fā)酵時(shí)間以24h為宜。則有:濾紙酶活力(FPIU/mL)2.2.2酵母用量對發(fā)酵結果的影響在pH值4.8、溫度為30C、纖維素酶用量為20FPI-=糖量(mg)X l(min)x 1000(umo/mmoI)x稀釋倍數U/g、不同的接種量條件下,48 h內發(fā)酵醪液中燃料乙醇180(mg/mmol)x60(min)x0.5(mL)β-葡萄糖苷酶的測定方法有多種D。根據高培基4濃度見(jiàn)圖2。(1988)的方法改進(jìn),取0.5 mL適當稀釋的粗酶液,加入1.5mLpH4.8.0.05mol/L的檸檬酸緩沖液配制的1%的1.0水楊苷,50 C恒溫水浴中酶解30 min,立即加入1.5 mLDNS試劑,沸水浴煮沸10min,定容至25mL,于540nm測0D值，并以加熱失活的酶液按照同樣的方式處理做0.4空白對照。.2在上述條件下,1min水解產(chǎn)生1umol葡萄糖所需0.0364的酶量定義為一個(gè)酶活單位(IU)。β-葡萄糖苷酶活力(IU/mL)圍2不同酵母用量下 水稻秸稈的同步糖化發(fā)酵=糖量(mg)xl(min)x1000(μumo/mmol)圖2表明，不同的接種量對水稻秸稈同步糖化發(fā)酵180(mg/mmol)x30(min)x0.5(mL).5 乙醇濃度和葡萄糖含量的測定方法生產(chǎn)燃料乙醇有很大的影響，其中在接種量為12 %時(shí)，同步糖化發(fā)酵過(guò)程中，每隔一定時(shí)間取發(fā)酵液適燃料乙醇濃度最大,為1.3 mg/mL,此時(shí)水稻秸稈原料乙量,適度稀釋后用生化分析儀分析其乙醇濃度和葡萄糖醇轉化率為6.52 %。含量。2.2.3 溫度對發(fā)酵結果的影響在pH值4.8、接種量為10%、纖維素酶用量為202結果與分析FPIU/g和不同溫度條件下，經(jīng)過(guò)48 h發(fā)酵,發(fā)酵醪液中2.1纖維素酶活 力燃料乙醇的濃度見(jiàn)圖3(A.B、C、D、E、F)。于28C,固體培養72h后,經(jīng)測定，濾紙酶活力為圖3表明，葡萄牙假絲酵母作用于水稻秸稈產(chǎn)燃料3.6 IU/g,β-葡萄糖苷酶活力為3.2 IU/g。乙醇具有廣溫性,在30~ -37 C之間燃料乙醇濃度相差不2.2發(fā)酵條件大;30 C時(shí),乙醇濃度最大,達1.3 mg/mL,只是在48h才2.2.1發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵結果的影響達到這一- 最高值;32 C時(shí)，乙醇濃度在24 h就達到最大將種子液按10%接種量接種于固體發(fā)酵培養基,起值,為1.267 mg/mL;37 C時(shí),乙醇濃度在24h達到最大始pH4.8,纖維素酶用量20 FPIU/g,于30 C培養,每隔值，中國煤化工醇濃度明顯開(kāi)始降低;- -定時(shí)間測還原糖濃度和乙醇產(chǎn)量。50,為二級種子液帶人的圖1結果表明,在發(fā)酵的初期,纖維素酶作用于底2.2.4培養基起始pH值對發(fā)酵結果的影響乙醉YHCNMHG長(cháng)呈一直上升趨勢。物中纖維素成分所生成的葡萄糖只有少量被酵母利用生成乙醇,發(fā)酵液中游離的葡萄糖比較高。這可能是由于所在溫度為30°C、接種量為10%、纖維素酶用量為24沈進(jìn)軍趙劍鋒，張順萍,曹曉華，楊志堅,許明●.水稻秸稈同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的研究◆乙醇十還原糖+還原糖網(wǎng)L.51.5“1.0f◆1.00.5.50.022436時(shí)間(h)22436A:28 C發(fā)酵D:37 C發(fā)酵-+乙醇2 2.5[◆厶醇十還原糖:2.0tg 2.0張1.5.0 t◆◆0.5 t.0124836 48B:30 C發(fā)酵E:40 C發(fā)酵2.0「1.6「◆乙醇十還原糖一還原.41.0◆0.80.5|0.42.12C:32 C發(fā)酵F:50 C發(fā)酵圉3不同溫度下水稻秸稈的同步糖化發(fā)酵20 FPIU/g,不同pH值條件下,經(jīng)過(guò)48 h發(fā)酵,發(fā)酵醪液沈加成門(mén)的研究表明,0.2%的Tween-80對于以木中燃料乙醇的濃度見(jiàn)圖4。糖渣為底物的SSF有一定的促進(jìn)作用。早期和最近的研自1.4[◆4.5 +5←5.5究表明，添加表面活性劑能夠提高纖維素到葡萄糖的轉Y 1.2化率間。Castanon等7研究表明，添加Tween- -80后,48 h的報紙酶解率提高了14 %。但也有在添加表面活性劑后e 0.84作用相反的報道1-9。本實(shí)驗添加Tween -80對水稻秸稈.6-同步糖化發(fā)酵的影響結果見(jiàn)圖5。0.2圖5結果表明,Tween-80對于SSF作用不明顯,總體而言,Tween-80對于水稻秸稈的SSF沒(méi)有促進(jìn)作用，24 36僅在發(fā)酵的24h,添加0.05 %和0.50 %的Tween-80 對于水稻秸稈的SSF有-定的促進(jìn)作用,比對照分別提高圖4不同pH下水稻秸稈的同步糖化發(fā)酵圖4表明,發(fā)酵液在不同的pH(4.5~5.5)下對水稻”2.3發(fā)酵各件的正亦試瞼絲果17.90 %和28.62 %。秸稈同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的影響不大，說(shuō)明水稻中國煤化工基本確定水稻秸稈同秸稈同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇在這一pH范圍內具有步糖化|YHCNMHG件為:pH值為4.5、溫廣適性,其中在pH值4.5時(shí)發(fā)酵醪液中燃料乙醇濃度達度為37C、接種量為12%、發(fā)酵周期為24h。為了獲得最大,為1.233 mg/mL。最佳的發(fā)酵條件，需要對影響燃料乙醇產(chǎn)率的因素進(jìn)行2.2.5 Tween -80對SSF的影響25釀酒科技2010 年第2期(總第188期).LIQUOR MAKING SCIENCE & TECHNOLOGY 2010 No.2(ToL.188◆0. 05%-古- 0.20%*- 1. 00%響來(lái)看，各個(gè)因子影響燃料乙醇濃度的順序分別是1.4 +0, 10%* 0. 50%Al=A2> A3.B1> B2> B3、C2= C3>C1.D3> D2> D1,因此可以確定最佳條件組合為AB.C2D3、A.B,CD3、.0 tA.B.CD3 A2B,C.D3,即時(shí)間為12h或24h、溫度32 C、0.8 tpH4.0或4.5、接種量12 %。.6-③從各因子的極差大小RD> RB> RA= RC可知，0.4 t在發(fā)酵條件中,對乙醇濃度影響最大的是酵母用量,其次.2|是溫度,而時(shí)間和pH的影響是最小的。.0 L236483結論.時(shí)間(h)水稻秸稈同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的適宜的發(fā)酵圍5 Tween-80 對水稻秸稈同步糖化發(fā)酵的影響工藝條件為:起始pH值為4.0~ 4.5,培養溫度為32 C,優(yōu)化組合試驗。對發(fā)酵條件中的時(shí)間、溫度、pH值和接種接種量為12%,發(fā)酵時(shí)間12~24 h。在此條件下,生成乙量等4個(gè)因素進(jìn)行了正交試驗，試驗設計及試驗結果見(jiàn)醇的濃度為1.4 mg/mL,水稻秸稈原料的乙醇轉化率為表1。7.02 %。表1 Lg(3) 正交實(shí)驗結果及分析因素乙醇濃度參考文獻:實(shí)驗號A(時(shí)間,h) B(溫度,C) C(lH) D(接種量，) (/咖_ [1] 徐昶,龍敏南,鄔小兵,等. 高產(chǎn)纖維素酶黹株的篩選及產(chǎn)酶條1(12)1(32) 1(3. 5)1(8)1.1件研究[]廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)2005,44(1):107.2(37)2(4.0)2(10)1.3[2] Ghose T K.Measurement of cllulase aivitis([]Pure Appl3(40) 3(4. 5)3(12)Chem, 1987 ,59(2):257- 268.2(24)1(32) 2(4. 0)1.4[3]李華，高麗β-葡萄糖苷酶活性測定方法的研究進(jìn)展[]食品3(4.5)與生物技術(shù)學(xué)報,2007,26(2): 107-114.3(40)1(3. 5)[4] 高培基,曲音波, E祖農.纖維素酶解過(guò)程的分析和測定[].生3(36)1(32) 3(4. 5)1.物工程學(xué)報，1988,4(4):321-325.1(3.5)3 (36)3(40) 2(4. 0)1.0[$] 沈加 成.酶解工業(yè)纖維廢渣生成乙醇技術(shù)的研究[D].濟南:山(112. 33312. 66712 00010. 667東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室,2008.12. 333 12. 33312. 667[6] Helle SS,Duss SJB,Cooper DG.ffect of surfactants on cllulose312. 00011. 667 12. 33313. 333hydrolysis(J].Biotechnol Bioeng 1993;42(5)611-7.0. 3331.000 0. 3332. 666[7] Castanon M,Wilke CR.ffects of the surfactant Tween-80 onenzymatic hydrolysis of newspaper[J].Biotechnol Bioeng,1981 ,由表1結果可以看出:XXII:1365-72.①在9個(gè)處理的直觀(guān)分析中,第4個(gè)組合條件下燃[8] Kurakake M,Ooshima H,Kato J,Harano YPretreatment ofbegase by nonionic surfactant for the enzymatic hyrolyis([].料乙醇濃度最高,為1.4 mg/mL。從而可以確定第4個(gè)組Bioresour Technol 1994 ,49:247 -51.合A2B,C2D,為最佳條件組合。②從各個(gè)因子不同水平條件對燃料乙醇濃度的影[9] Kaar WE,Holtzapple M.Benefts from Tween during enzymichydrolysis of com sover[J]Bitechnol Bioeng 1998,59:419 -27.(上接第22頁(yè))縮短為36h,酒精度達到了4.7 %vol。eters[J]. 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